发酵过程控制（ControlofFermentationProcess)第四章生物传感器简介

1、发酵过程控制（Control of Fermentation Process)第四章生物传感器简介第四章 生物传感器4.1 概述4.2 生物传感器基本原理4.3 酶传感器4.4 微生物传感器4.5 其他生物传感器什么是传感器？某工艺参数 传感器 电、热、光 变换器 电信号转换器数字量传感器三要素：（1）直接触被测物；（2）可传递性；（3）输出信号与被测参数有明确的关系，最好是线性关系。4.1 概述4.1.1 什么是生物传感器功能：被测物质浓度生物传感器可传递信号数字量组成：生物传感器 固定化生物材料具有专一性功能（感受器）转换器具有传递性功能生物传感器的发展历程：酶法分析具有高度专一性，但操作

2、复杂、时间长。固定化酶使酶法分析自动化，但不具备传递性，只能取样检测。电极具传递性，但不具备专一性。氧电极pH电极生物传感器的发展历程：4.1.2 生物传感器的特点（1）特异性好：能从复杂的系统中准确测出某一物质的浓度。（2）灵敏度高：可检测浓度的物质，最小极限为10-10g/mL。（3）稳定性相对较差：检测结果易受物理和化学环境因素的影响。（4）不能加热杀菌处理：其中的生物物质有失活的可能，因此一般不能加热杀菌处理。（5）制作工艺精细，废品率高，成本昂贵。4.1.3 生物传感器的分类 （1）根据生物物质分类（感受器）酶传感器各种酶微生物传感器微生物细胞细胞器传感器细胞膜、线粒体、电子传递体、

3、微粒体等细胞器组织传感器细胞组织免疫传感器抗原、抗体基因（DNA）传感器核酸（DNA、RNA）生物传感器 感受器转换器（2）根据转换器分类 生物物质发出的信号 转换器 可传递信号信号转换器生物反应产生的信号电极式各种电极活性物质，如O2、CO2、H+、NH4+等热敏电阻式热光电纤维式光半导体式电场压电晶体式气体等离子体共振式磁场4.1.4 应用领域与前景生物传感器的应用领域（1）在酵工业方面：主要是各种酶传感器和微生物传感器 如：糖、甲醇、乙醇、醋酸、甲酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、抗生物质、氨、甲烷、BOD及菌体数等生物传感器 。（2）环境检测方面：应用较多的是各种微生物传感器 如：

4、BOD、NH3、NOX、SOX、甲烷及各种重金属离子等BOD、NH3、NOX、SOX、甲烷及各种重金属离子等。 （3）医疗方面：主要是酶传感器、免疫传感器、基因传感器 如：血清检查和尿样检查等。 （4）食品分析：主要是各种酶传感器、免疫传感器4.2 生物传感器的原理电极式生物传感器原理电极式生物传感器 电极式生物传感的组成：电极活性物质 电 极被测物质膜生物催化剂酶 、微生物抗体、抗原细胞器、细胞组织输出电信号电化学反应电极式生物传感器原理示意图 电极式生物传感器原理模式：被测物质 固定化生物催化剂膜 电极活性物质 电 极 电信号 生物化学反应电化学反应电极活性物质电极活性物质指易于在电极上反

5、应的物质，如：O2、CO2、H2O2、H+、NH3等 。例如：被测物质生物催化剂膜电极活性物质(反应生成或消耗物质) 电极乳酸乳酸氧化酶膜消耗O2氧电极(电流)L-赖氨酸L-赖氨酸脱羧酶膜生成CO2CO2 电极(电压)电极的转换方式电流法电极活性物质在电极上反应产生电流。 常用电极有：氧电极、H2O2电极、燃料电池型电极等。电压法电极活性物质有选择地感应产生膜电压。 常用电极有：离子选择电极、氨电极、CO2电极等。其它生物传感器原理 被测物质固定化生物催化剂膜 热 热敏电阻 电信号 生物化学反应被测物质固定化生物催化剂膜 光 光计数器 电信号 生物化学反应其他信号： 电场电场磁场4.3 酶传感

6、器酶传感器是应用固定酶膜作为识别被测物质敏感元件（感受器）的生物传感器。酶传感器包括酶电极传感器、酶光纤传感器和酶热敏电阻传感器等。 Clack最初提出了使用酶进行电化学测定的原理。希克斯（Hicks）和厄迪克（Updick） 首先研制成了测定葡萄糖的酶传感器。 4.3.1 酶反应与转换器的耦联耦联关系是指酶反应所生成（如：H2O2、CO2等）或消耗（如O2等）的某种物质，能被转换器转换成电信号。 酶传感器中转换器与酶反应的耦联关系酶 例耦联物质转换器转换器输出信号氧化酶、过氧化氢酶等O2氧电极电流H2O2H2O2电极电流脱氢酶NADH燃料电极电流尿酶、酰氨酶NH4+ （酸性）铵电极电压尿酶、

7、脱氨酶NH3（碱性）氨电极电压脱羧酶CO2CO2电极电压脂肪酶、青霉素酶H+玻璃电极电压4.3.2 固定化酶膜（EBM）的制备（1）固定化方法包埋法：活性损失最小，但不适于测量大分子底物；共价法、交联法：活性损失较大，适应性较广。（2）酶膜制备酶膜制备实例:将乙醇氧化酶和聚乙烯亚胺及牛血清蛋白溶液混合起来，加入5%（V）戊二醛溶液，在5下，存放4小时。这种酶的混合物包在聚碳酸脂膜（孔径）和醋酸纤维素膜之间，并在5使其风干24h。用0.02%（V）戊二醛溶液处理，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制得乙醇氧化酶膜(厚度约20m)。（3）酶膜的性质 使用寿命：与使用环境条件（温度、pH等）有关，一般为一个月

8、左右。响应特性:4.3.3 酶传感器实例 例1：葡萄糖传感器：传感器组成： 葡萄糖氧化酶聚丙烯酰胺凝胶 包埋法葡萄糖氧化酶膜 氧电极葡萄糖传感器葡萄糖传感器示意图 PbPt记录仪空气被测溶液电解质溶液聚四氟乙稀膜固定化葡萄糖氧化酶膜 例1：葡萄糖传感器： 电极反应： C6H12O6 + O2 葡萄糖氧化酶 C6H10O6 + H2 O2 葡萄糖 葡萄糖酸 在酶膜上： 在氧电极上：在Pb阳极：PbPb2+2e在Pt阴极：1/2O2+H2O+2e2OH PbPt记录仪空气被测溶液电解质溶液聚四氟乙稀膜固定化葡萄糖氧化酶膜测定原理： 主要性能 测量范围：1500 mg/L 响应时间：1030 s 使

9、用寿命：60100 day葡萄糖 酶催化反应 电极旁O2浓度电化学反应 电流值葡萄糖浓度 酶膜上 氧电极上 氧化酶膜与过氧化氢电极组成葡萄糖传感器： 例2：乙醇传感器： 传感器组成：将固定化乙醇氧化酶膜用圆形橡胶环装在过氧化氢电极的表面，即组成乙醇传感器。 电极反应： 酶膜上的反应：乙醇 乙醛电极上的反应：在Pt阳极上：H2O22H+O2+2e在Ag阴极上：1/2O2+2H+2eH2O测定原理 电极主要性能乙醇 酶催化反应 生成H2O2 电化学反应 电流值推算乙醇浓度 乙醇氧化酶膜 H2O2电极A测量范围：030%（V）；B相对误差：2%；C响应时间：20S；D使用寿命：半衰期30天左右。某些

10、酶传感器一览表待测物质固定化酶转换器测量范围(mg/L)响应时间（min）稳定性(day)葡萄糖葡萄氧化酶铂电(H2O2)氧电极(O2)151031510215(S)10(S)60100100各种糖蔗糖酶、变旋酶葡萄糖氧化酶氧电极(O2)1005000514乳酸乳酸脱氢酶燃料电极(NADH)100030 (S)14乙醇乙醇脱氢酶乙醇氧化酶原电池铂电极(H2O2)1430尿素尿酶铵电极(NH4+)氨电极(NH3)1010001010000.51242130青霉素青霉素酶玻璃电极(H+)1010000.52714L-酪氨酸酪氨酸脱羧酶CO2电极(CO2)1010412204.4 微生物传感器在酶传

11、感器制造中，首先遇到的困难就是酶的提取与精制。 微生物膜作为分子识别元件利用：利用微生物细胞内单一或多个酶的机能类似于酶传感器；利用微生物的生理机能。4.4.1 微生物传感器的原理与分类酶活性测定型以微生物酶催化反应的活性为指标；（类似于酶传感器）呼吸活性测定型以微生物呼吸活性为指标；电极活性物质测定型以微生物代谢产物为指标。（1）呼吸活性测定型必须是好气性微生物氧浓度 氧电极 电流值 CO2生成 CO2电极 电位值 氧 微生物利用的被测物质好气微生物膜（2）电极活性物质测定型包括厌氧和好氧微生物待测物质固定化微生物膜 CO2 CO2电极 电位式 H2 铂阳极，Ag2O2阴极 电流式 NH3

12、氨电极 电位式 H+ 玻璃电极 电位式 还原型辅酶 燃料电极 电流式 4.4.2 微生物传感器特点（1）微生物较酶易获得，价格相对较低；（2）稳定性好，连续使用时间可达一个月左右；（3）响应时间比酶传感器长，多数在10分钟左右；（4）特异性较酶传感器差。 4.4.3 微生物传感器实例例1：谷氨酸传感器谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸的反应为： HOOC-(CH2)2-CHNH2-COOH 谷氨酸脱羧酶 HOOC-(CH2)2-CH2NH2 + CO2（1）传感器制备大肠杆菌细胞冷冻干燥用水调匀涂布于尼龙网（60目，7mm）两面置于CO2电极上外用赛璐酚膜盖住谷氨酸传感器电极膜（硅橡胶膜）细胞尼龙网(大肠

13、杆菌)赛璐酚膜 CO2 电 极（2）测定原理（3）主要性能 A响应时间：5min左右； B测量范围：10800mg/L； C使用寿命：20day。 在无氧条件下 （4）专一性： A对谷氨酰胺有响应，对其它氨基酸的作用可忽略。 B葡萄糖、醋酸时，无影响。 C无机离子影响可忽略。 例2：氨传感器（1）测定原理硝化菌氧化铵的反应要消耗氧：NH4+ + O2 硝酸菌 NO2NO2 + O2 硝化细菌 NO3 NH4+ 微生物反应 电极旁O2浓度电化学反应 电流值推算NH4+浓度 硝化菌膜上 氧电极上（2）传感器制备活性污泥 分离 硝化菌固定于乙酸纤维素膜安装于氧电极上测定铵（氨）微生物传感器 氧电极

14、Pt乙酸纤维素膜(硝化菌)透气膜聚四氟乙烯膜（3）主要特性响应时间：2min(pH=10的缓冲溶液中)测量范围：142 mg/L相对误差：14乙醇T. brassicae氧电极5301030醋酸T. Brassicae氧电极101001020甲酸C. butyricum铂阳极、Ag2O2阴极13003030谷氨酸E. ColiSarcina flaveCO2电极NH3电极10800201000552014赖氨酸E. coliCO2电极10200514天冬氨酸B. CacaverisNH3电极0.590510头孢菌素Citrobacter fenundipH电极100500107其他生物传感器免

15、疫电极传感器免疫电极(immuno bioelectrode)是以免疫物质（抗原或抗体）作为敏感元件的电化学生物传感器。免疫物质的高特异性识别使免疫电极具有很高的特异性。 根据测定过程是否需要标记物可分为直接免疫电极（direct immuno electrode）和间接免疫电极（indirect immuno electrode）。 （1）直接免疫电极不用任何标记物 例如（设抗体为被测物）：抗体电信号（电压）电化学或电学变化膜电压变化特点：不需额外试剂，仪器要求简单，操作容易，响应快；缺点：灵敏度低，因而难以作为标准检测方法 （2）间接免疫电极需要制备酶标抗体或酶标抗原结合物 利用标记物将免

16、疫反应的信号放大后间接测定抗原或抗体，这类电极称为间接免疫电极，亦称酶联免疫测定法或ELISA法（enzyme linked immunoassay）。例如（设抗体为被测物）：推测试样中抗体浓度 抗体 固定化酶标抗原膜抗体与酶标抗原结合 改变酶标抗原存在状态固定化酶标抗原膜底物状态改变的酶标抗原催化底物反应 反应速度与试样中抗体浓度有关 4.5.2 DNA传感器DNA测定主要指靶DNA的检测、DNA序列测定和DNA杂交测定。DNA测定在分子生物学及其基因操作研究、临床诊断、反恐侦检、食品安全、检疫等方面应用广泛。传统的DNA检测主要依靠膜上分子杂交和电泳，其特点是技术要求高，时间长、成本高、效

17、率低。近年来DNA传感器和DNA列阵的出现，使DNA的检测大大减化。（1）DNA传感器的特点特异性好。稳定性好离体DNA比蛋白质（酶）分子稳定。制备简单，DNA可用仪器批量合成。DNA的操作方法具有通用性，容易标准化。结合芯片技术，可制备DNA列阵，实现高通量测定。灵敏度高，可以达到10-11mol/L以上。用途极其广泛。（2）DNA传感器的分类按转换器的不同可分为电极型（电化学型）、光学型和质量型等。其中应用最广泛的电极型DNA传感器，根据其作用原理的不同可分为五大类：A. 直接DNA电化学型（direct DNA electrochemistry）B. 间接DNA电化学型（indirect DNA electrochemistry）C. 特异性氧化还原指示剂型（specific redox indicator）D. DNA介导的带电输出型（DNA-mediated charge transport）E. 纳