临床基因扩增诊断实验室工作规范(试行)

1、附件2临床基因扩增（PCR）诊断试验室工作法律规范（试行）为使基因扩增诊断技术法律规范有效的用于临床，保证检测质量，更好地为临床疾病的 诊疗服务，特制定本法律规范。1.临床基因扩增试验室的设置：和仪器设施临床PCR试验室应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设施。即1） 试剂贮存和预备区；2）标本制备区；3）扩增反响混合物配制和扩增区和的扩增产物分析区。 如使用扩增和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动分析仪如Cobas-T （Anplicor）等，那么3）和4）两个区可合并。与上述特定试验区有关的各个房间必需有明确的标记，以避开不同工作区内的设施物品 如加样器、试剂等的移

2、出或不同的工作区间发生混淆。进入各个工作区必需遵循一严格的） 挨次，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和预备区标本制备区扩增反响混合物配制和 扩增区扩增产物分析区。不同的工作区必需使用不同的工作服，可以不同的颜色来区分。 此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。1. 1试剂贮存和预备区本区用于贮存溶液的制条、溶液的分装和主反响混合液的制各。本区仪器设施配置：（1） 4冰箱和一 20冰柜；（2）混匀器；（3）微量加样器假设干支（掩盖11。00优）；（5）专用 工作服和工作鞋；（6）专用办公用品；（7）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压 处理的离。心管和加样器吸头（带滤心）

3、；（8）可移动紫外灯（近工作台面）。1. 2.标本制备区标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。RNA测定时的单键。cDNA合成也在本 区进行。本区仪器设施自己置：（1） 4冰箱、一20或-70冰柜三（2）高达台式冷冻离心 机；（3）混匀器；（4）水浴箱或加热模块；（5）微量如排器假设干支（掩盖11000U1）； （6） 专用工作服和工作鞋；（7）专用办公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高 压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（9）可移动紫外灯（近工作台面）；（10）超净工 作台；（11）超声波水浴（处理大分子DNA适用）。1. 3.扩增反响混合物配制和扩增区模板材料（来自标

4、本制备区）和主反响混合液（来自试剂贮存和预备区）的加入以及扩 增反响等特地在本二.作区内近行。本区仪器设施自己置：（1）核酸扩增仅三（2）微量加 样器（掩盖11000 U1）； （3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办公用品；（5）消耗品：一 次性手套、一次性吸水纸、高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯 （近工作台面）。4.扩增产物分析区本区面积应为68m o扩增严物的分析在本区进行。本区仪器设施配置：视检测方法 不同而定，如为PCRELISA,那么需（1）微量加样器假设干支（掩盖12s （2）酶标权、 洗报机和恒温箱；（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办么，用品；（5）

5、消耗品：次性手 套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。2 .临床基因扩增诊断试验室质量保证临床基因扩增诊断试验室质量保证涉及到整个基因扩增检测的全部阶段，即测定分析前 的标原来集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。1.标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或拘檬酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血 浆.痰、脑普液、尿及分泌物等。采样容器最好是密闭的一次性的，如真空系血管。一次性 塑料容器使用时无需进一步预处理。当使用非密闹采样系统时 如尿、分泌物和骨髓的采禅, 必需留意防止来自来样者的皮屑或分泌物的污染。采样者采样时起码要谈.一

6、次性手套。可 重复使用的玻璃器（应高压处理，由于玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要 来源是试验人员的手。最好是热灭菌，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全 血和骨髓标本必需进行抗凝处理。通常EDTA和拘檬酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素 抗凝，由于肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除肝素。临床用 于RNA （如HCVRNA）测定的血标本最好进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分别血浆, 以避开RNA的降解。如未作抗凝处理，那么物血后，必需在1小时内分别血清。2.标本的稳定化处DNA分析，标本采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应准时送到试验室。

7、由 于RNA易于降解，因此用于RNA测定的标本的稳定化处理有时是必不行少的，Chaotropic 物质特殊是异硫氨酸抓盐（Guanidine thiocyanate, GITC）可使DNAse和RNAse马上失活。 在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆加入含有GITC的试剂管中进行稳定化处理。 GITC可使RNAse不行逆失活的适合浓度为5moi/L。假如GITC浓度小于4mol / L； RNA 会很快降解。在适当的稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。假如温度低于室温, GITC即会结晶，所以在加入标本前应使之完全溶解。如标本不能准时送到试验室，最好选 用GITC处理方法以稳定标本。

8、3标本的运送标原来集后应尽快送至试验室，经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。 如用于DNA提取的含EDTA的全血标本及用于RNA提取的经GITC稳定化处理的标 本。是否冷藏取决于标本的用途，较长时间在室温贮存会导致灵敏度大大降低。通常应采纳 不易破裂的容器装载标本。用于RNA检测的标本，假如在未经稳定化处理，那么必需速冻后, 放在干冰中运送。4.标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的核酸样本应在 lOmmol / L Tris, Immol / L EDTA 缓冲液（pH 7. 5-8. 0）中 4 保存。用于 RNA 测定 的核酸样本应在缓冲

9、液中一 80 C或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在一 20OC即 可。用GIT （：稳定化处理的RNA标本在室温可保存7天，如贮存时间较长，那么RNA测 定敏感性略有下降。5.标本的处理（核酸提取）核酸提取是打算扩增检测成败的关键性步骤。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不 完全所致。抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中 确.留的有机溶剂（如酚、氯份等），这些物质对其后的酶反响步骤具有剧烈的抑制作用， 从而影响靶核酸的扩增测定。如在HBVDNA PCR测定中。采纳对血清杯水煮沸裂解以释 放DNA的方法时，肉眼观看不明显的溶血也会对扩增测定有很强的抑制

10、作用，应使用正规 的核酸提取方法（如经典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。当标本为疾时，那么必需先进 行液化处理。再提取核酸。需留意的是；液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶 核酸为RNA时，降解是一个主要问题。RTPCR测定失败的常见缘由是标本在运送前来 经充分的稳定化处理.及核酸提取试剂的RNase的污染。对于前者，要核查测定分析前的 步骤，假如没.现RNA降解的证据。试验室那么应拒绝接受标本，要求重新实行标本，并对 运送者给以具体的指导。对于后者，建议常规使用高质量的商品核酸提取试剂。6靶核酸的逆转录和扩增6靶RNA的逆转录cDNA合成为RT-PCR中的第一个酶反响步骤，所产生的

11、cDNA为靶RNA的反向互补 链。为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDNA合成的效率：RT活性的降低或完全缺乏。必需排解由于酶质量不高、试剂降解或加样错误而引起 的cDNA合成不充分。RT或热稳定聚合酶的抑制物（如酚、血红素）。当RNA明显为完整而没有扩增口寸, 应怀疑有此类抑制物。RNA的降解。6. 2影响扩增的因素有多种因素可引起PCR的假阳性或假阴性结果，如抑制剂或酶活性丧失（见上）、迟大 温度不对、晚十十浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。反响孔中热传导的均一性极为重要, 循环仪的温度掌握和加热块中热传导的全都性必需有常规的检查以避开假阴性结果。7污染在实际工作中，常见有以下几种污染类

12、型：PCR片段的污染（产物污染）三自然 基 因组DNA的污染；试剂污染（贮存液或工作液）：以及交及污染（如气溶胶从一个阳性标 本集中到原本阴性的标本）。对于全部的扩增技术，由于围绕试验室来查找污染源不仅耗时 而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。一旦发生了污染，试验就必需停止，直到觉察了污 染源为止。假如没有例外，试验结果必需作废，即使平行的污染质控中仅有一管显示出有 PCR片段污染。7. 1.测定分析前的污染源。测定分析前试验材料的污染主要来自非病人标原来源的核酸。7. 2.测定分析阶段的污染源。通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反响混合液的任何成分及核酸 的制备和反响建立阶段

13、所涉及到的试验设施的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂 （例如今血清白蛋白，明腋成矿物油）；商品酶制剂；消耗品（如反响管，吸头）和试验设 施（如加样器、离心机）。污染的来源之一是很多样本在同时制备时的交及污染，但最主要 的污染来源为以前扩增产生的特异产物DNA片段。在前面三个工作区中，不当的试验操作 会引起所使用的试剂、消耗品或试验设施的污染。而在产物分析区，当吸取PCR产物用于 检测时，特别简单引起污染，因此必需制定并严格执行标准操作程序。7. 3.污染的避开。要避开污染，首先应是预防而不是排解污染，前面所述工作区的严格划分的目的正是为 了预防污染。为避开以前测定中所产生的扩增产物的污

14、染，可设法将其破坏掉。如在扩增反 应中用dUTP取代局部dTTP：从而产生的特异扩增片段含有尿啥咤，这样扩增前在反响混 合液中加入尿喀咤糖激酸（UNG）,可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避开其对将要进 行的扩增测定的污染。此外一种方法是持续的长波紫外灯照耀，通过异补骨脂素光化；单产 生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反响但又不阻碍PCR后杂交过程，所以这些 方法也能防止污染。由于上面提到的方法会给人一种假的平安感，所以不能以其来替代严格 的试验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的自然 DNA的污染。7. 4.去除污染的措施。工作完后必需定期实行有效的去污染措施，结合各种不

15、同的方法可到达最正确效果。去污 染措施包括但不仅限下面几种：用100ml/L次氨酸钠清洁外表；试验了后长时间的紫外照 耀试验操作台和其他外表；试验设施如加样器的高压消毒。8.扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法。如电泳、限制性酶切、斑点印迹、杂交、测序、分光光度 法定量等。但临床PCR测定工程基本上都使用探针杂交方法。8. 1.与杂交检测有关的干扰。杂交结果不充分的缘由可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂 交或洗涤方法不合适。最常使用的基因探针有：DNA片段、合成的尊核普酸和体外的转录 本（反义RNA探针）。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光景和同位素等。在扩 增后

16、的杂交检测中，应当严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子 强度太高都会降低杂交的严格性。还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高润度 和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密掌握温度和试剂是避开假阳性和假阴 性结果的先决条件，要留意的是，温度和离子强度不能同时转变。2.9.质量掌握如上所述，应当开展各种质控来评价测定分析当中各步骤的质量，如RNA的完整性、 对扩增是否合适和敏感。2. 9. 1.室内质量掌握必需对DNA和RNA分析的各步进行质量掌握，以避开假阳性和假阴性，保证测定结 果的精确性。由于PCR测定的高敏感性，所以试剂的生产、试验材料的预备、PCR本

17、身和试验中的每一步都要求有质控。扩增反响前后的酶反响各步也应有质控，只不 过在质控细节上稍有不同。2.9.1.1.与试验材料的预备有关的质控。对DNA提取试剂的效果最常用球脂糖凝胶电冰来检测。可知所提取的DNA是否发生 降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为100kb,用适合PCR的DNA 提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为3040kb。然而；明显消失降解的DNA （在 1和10kb的低分子量范围内）在经琼脂糖凝胶电冰分别和用漠化乙锭染色后也可见有强的 荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶（如EcoRI）消化DNA,然后电泳分别，能 够对酶活性的抑制剂进行质控（在抑制剂

18、存在的状况下，高分子量的片段不被酶切）。潜在 的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估量，好的DNA提取物， A260/A280比值应当在1. 75-2. 0之间；否那么，污染（残留的蛋白或酚）可能会很高。 仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。最快的对总RNA提取质量掌握的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电冰，这一点跟 DNA分别相同，然而，假如对结果产生怀疑，就应当在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以 检测RNA的完整性。在抱负状况下，三种主要的核糖体RNA（28S、18s和5S）在凝胶上 消失的带相对较窄。如发生RNA的降解。那么带被拖向低分子量或消失带的缺失。测

19、定核糖 体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的试验室内的标准；对向低分子量拖 尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。此外，琼脂糖凝胶电泳能显示 出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些缘由，单独的光电比色不能对RNA的完 整性下结论。9. 1. 2.对cDNA合成和扩增的质控。本局部包括阳性质控和阴性质控。9. 1. 2. 1. cDNA 的合成。对CDNA合成的效率进行监控的关键性的质控是使用一个内反响质控。cDNA的合成 可以从存在子每一个RNA提取物中的cRNA转录本开头（即普遍表达的mRNA,如核糖体 蛋白转录本这一类的所谓的管家基因），也可从在制备时

20、加入样本中的作为内标准的RNA 开头。cDNA合成的内质控是能够产生确定产物的阳性质控；假如扩增不胜利，质控就显示 出有RNA的降解、cDNA合成的过程中错误启动或酶活性丧失。加入确定量的扩增质控物可以检测RTPCR的灵敏度。对于RT-PCR方法 所必需 的污染质控为无逆转录靶RNA的阴性质控。2. 9. 1. 2. 2. PCR 反响。内反响质控是阳性质控。可使用对有机体存活所必需的靶基因作质按，这些基因至少以 丰台子状态存在，由于假如基因组缺失这些基因，将使有机体致死（所谓的致死因子），一 个比拟好的例子就是维生素D血浆结合蛋白的基因；在世界范围内的很多种族已觉察其广 泛的多态性，并且还没有觉察基因活性的同源性丧失，因此，通过PCR共同扩增这种基因 的一个片段，在全部患者中均可获得胜利，并且也会证明扩增反响是胜利的。在测定血清/血浆病原体核酸如HBVDNA、HCVRNA等时，应使用的弱阳性血 清/血浆作为质控样本，与持测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以推断扩增检测的有效 性。使用这些外加弱阳性