实验六七及考试小结

1、动物肝组织中总DNA的提取与定量2012.11.11-2012.11.15生物化学与基础分子生物学实验课程六DNA提取中为什么要避免残留过高浓度的有机溶剂和金属离子？后续实验？PCR，酶切，测序. 有机溶剂的影响：DNA理化性质，结构.金属离子的影响：酶催化活性思考题试述DNA的浓度鉴定和纯度鉴定的主要方法。紫外分光光度法（最常用的浓度及纯度鉴定方法）琼脂糖凝胶电泳法（纯度鉴定常用方法）溴化乙锭法（污染大）荧光光度法思考题* 细胞裂解GA裂解液可能成分：碱，SDS；必须保证混合均匀（上下颠倒数次）；水浴* 沉淀DNA无水乙醇必须保证混合均匀（剧烈振荡）完全转移洗脱洗脱液TE：可溶解DNA的缓冲

2、液，可用超纯水代替足够量（覆盖硅基质膜）多次洗脱离心要点难点* 稀释倍数计算的是稀释前的样品浓度，需要考虑稀释倍数计算的是样品含量，需考虑稀释后体积* OD260：OD2801.7-1.9之间为好过高：RNA污染；DNA降解或断裂过低：蛋白质污染要点难点 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。2、核酸样品纯度判断的一般标准： DNA纯度：O

3、D260/OD2801.8，表示为纯的DNA； OD260/OD280 1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 RNA纯度：1.7 OD260/OD2802.0，表示为纯的RNA； OD260/OD280 1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 2.0时，表示可能有异硫氰酸残存。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和PCR的效果。DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在

4、溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。对策DNA提取常见问题 原因材料不新鲜反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻

5、融问题二：DNA降解对策DNA提取常见问题 原因实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少对策 原因DNA提取常见问题香菇多糖的提取与含量测定2013.11.18-2012.11.22生物化学与基础分子生物学实验课程七单独操作时间:20分钟. 标准曲线+样品测试，共20个样品每个样品两个复孔. 先在EP管中按下表配制, 再加样,每

6、孔加样150ul.012345678样品标准糖（ul）0203040506070809050水（ul）100807060504030201050苯酚（ul）50 （尽快迅速混匀）浓硫酸（ul）250 （硫酸均匀沿管壁流下，尽快迅速混匀）混匀后放置20min，490nm测紫外吸收实验操作考试 酶标仪测定多糖的含量1. 实验操作（15分） 完成标准曲线及测试样品溶液的配备与检测 2. 数据处理（3分） 每个样品两个复孔，取平均值, 规范性作标曲 求出相关系数及标准方程.3. 实验结果（2分） R2, 未知样品浓度, 偏离度实验操作考试1. 实验操作（15分） *移液枪的正确选择(1分) *正确调量

7、程(2分) *移液取液的规范性(2分) *放液的规范性(2分) *使用移液枪吹打混匀的规范性(2分) *使用完毕量程复位(2分) *操作过程的整洁度(2分) *实验过程的安全防护(2分) 评分标准2. 数据处理（3分） *扣除空白,原点过零(1分) *标准曲线作图的规范性(2分) 包括标题,坐标的标示,单位,R2,方程的标示等3. 实验结果(2分) *R2 = 0.99, 2分 *R2 0.97, 0.5分 评分标准偏离度= (实测浓度 理论浓度)/ 理论浓度 *100%操作考试主要问题1、没有统筹安排实验。（调整量程，EP管排列与开合，均未安排好）2、吹打混匀基本不规范。3、不合理的开/合EP盖。每加一种试剂开合一次(加与被加的EP管都是)4、调量程:超量程调,反说枪坏。5、枪头浪费严重：移液到进样条时还换枪