DB15T 2593-2022冰草组织培养技术规程

1、ICS65.020.20CCSB 2115 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T 25932022冰草组织培养技术规程Technical code of practice for tissue culture of agropyron cristatum2022-06-24 发布2022-07-24 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 25932022前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。本文件主

2、要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。 I DB15/T 25932022冰草组织培养技术规程范围本文件规定了冰草组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。 本文件适用于冰草组织培养育苗。 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 DB 15/T 1940

3、-2020 西部沙樱组织培养技术规程 术语和定义NY/T 2306界定的术语和定义适用于本文件。 冰 草 agropyron cristatum (L.) gaertn属于禾本科（Gramineae）冰草属（Agropyron）多年生草本植物。 幼 穗 young ear生长2至5年、长度1 cm3 cm的冰草孕穗。种 子 seed有生活力、饱满的包含内外稃的冰草种子。成熟胚 mature embryo 完熟期冰草种子的胚。 4 环境与器具灭菌1 DB15/T 25932022参照DB15/T 1940执行。 5 培养基 基本培养基MS培养基、1/2MS、改良MS培养基见附录A。 母液的配制和

4、保存配制将常用试剂配制成50100倍的母液，按照GB/T 603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5 mg/mL，配制方法详见附录B。 保存母液配制好分别贴上标签，注明溶液名称、配制倍数、配制日期、配制者。母液贮存在4 的冰箱中。贮藏时间在3个月之内，有霉菌和沉淀产生，则不得使用。 培养基的配制5.3.1 配 制蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1 L。 pH 值调节用1 mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.86.0，用酸度计或精密pH试纸测定。 分装和灭菌配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/41/3为宜。切勿将培养基沾到瓶口和外壁上， 以免

5、招致杂菌污染。分装后立即加盖，不同的处理做好标记。分装后进行灭菌，121 状态下保持20 min。 6 外植体 外植体选择幼穗或成熟胚。 外植体制备幼穗在超净台上用75%酒精脱脂棉球擦洗叶鞘表面消毒，剥出幼穗，切成0.3 cm0.5 cm的小段。 成熟胚2 配置1 L培养基时，先加蒸馏水600 ml700 ml，再加入7.5 g琼脂，加热搅拌琼脂融化后加入25 gDB15/T 25932022种子用水浸泡2 h4 h后，剥去内外稃，置于湿滤纸上吸胀4 h。在超净工作台上75%酒精消毒30 s， 无菌水冲洗至少3次后用0.2%升汞消毒5 min，再用无菌水冲洗数次至少3次。置于铺有湿无菌滤纸的培

6、养皿中，用解剖针从盾片处挑出胚。 7 愈伤组织诱导培养幼穗培养基幼穗愈伤组织诱导培养基为改良MS+2.0 mg/L 2，4-D。 接种将幼穗段接种在愈伤组织诱导培养基上，每2.5 cm23 cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。 培养条件24 26 暗培养。 培养时间培养20 d30 d。 成熟胚培养基成熟胚愈伤组织诱导培养基为MS0.2 mol/L甘露醇+ 2.0 mg/L 2，4-D。 接种将成熟胚接种在愈伤组织诱导培养基上，每1.5 cm22 cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。 培养条件见本文件7.1.3。 培养时间培养14 d20 d。 8 增殖培养幼穗

7、培养基幼穗增殖培养基为改良MS+2.0 mg/L2，4-D+0.2 mg/L 6BA。 接种3 DB15/T 25932022在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每4 cm25 cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。 培养条件见7.1.3。 培养时间培养40 d50 d；每20 d换1次培养基。 成熟胚培养基成熟胚增殖培养基为MS0.2 mol/L甘露醇+2.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L ABA。 接种在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每3 cm24 cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。 培养条件见7.1.3。 8.

8、2.4 培养时间培养40 d60 d；每20 d换1次培养基。 9 分化培养幼穗培养基幼穗分化培养基为MS+3.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。 接种在超净工作台上，挑选状态较好的胚性愈伤组织转入分化培养基，每5 cm26 cm2接种1个，均匀摆放，封好瓶口，标明名称和日期。 培养条件24 26 ，全天光照培养，光照强度3000 Lux4000 Lux。 培养时间培养40 d60 d；每20 d换1次培养基。 成熟胚9.2.1 培养基4 DB15/T 25932022成熟胚分化培养基为MS3.0 mg/L KT1.0 mg/L NAA。 接种在超净工作台上，挑选状态较好的胚性愈伤

9、组织转入分化培养基，每5 cm26 cm2接种1个，均匀摆放，封好瓶口，标明名称和日期。 培养条件24 26 ，每天光照时间16 h，光照强度3000 Lux4000 Lux。 培养时间培养60 d90 d；每20 d换1次培养基。 10 生根培养 幼穗培养基幼穗生根培养基为改良1/2 MS+0.1 mg/L NAA。 接种在超净工作台上，将长至3 cm4 cm的小苗逐一转入生根培养基，每器皿接种1苗，封好瓶口，标明名称和日期。 培养条件见9.1.3。 培养时间培养20 d30 d。 成熟胚培养基成熟胚生根培养基为1/2 MS0.5 mg/L NAA。 接种在超净工作台上，将长至3 cm4 c

10、m的小苗逐一转入生根培养基中，每器皿接种1苗，封好瓶口， 标明名称和日期。 培养条件见9.2.3。培养时间培养20 d30 d。 5 DB15/T 2593202211 炼苗与移栽炼苗选择生长健壮的组培苗，打开封口膜，放在自然光、室温下2 d3 d。 基质营养土与蛭石1:1混合。经高压灭菌后装入花盆备用。 移栽取出组培苗，洗掉培养基，栽入花盆，浇水，放入温室，套上带孔的塑料袋保湿，一周后取掉，适当保温，常规管理。待苗长至20 cm30 cm移栽至大田。 6 DB15/T 25932022AA 附 录 A（规范性） 基本培养基成分基本培养基成分见表A.1 。 表A.1 基本培养基成分类型 组分

11、MS 培养基 改良 MS 培养基 大量元素 KNO3 1900.0 1900.0 NH4NO3 1650.0 956.0 MgSO47H2O 370.0 370.0 KH2PO4 170.0 1160.0 CaCl22H2O 440.0 96.0 微量元素 MnSO44H2O 22.30 22.30 ZnSO47H2O 8.600 8.600 H3BO3 6.200 6.200 KI 0.830 0.830 Na2MoO46H2O 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 铁盐 Na2-EDTA 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 有机物 甘氨酸 2.000 2.000 盐酸吡哆辛 0.500 0.500 盐酸硫铵素 0.100 2.000 烟酸 0.500 1.000 肌醇 100.0 100.0 尼克酸 - - 7 DB15/T 25932022BB 附 录 B（规范性） 激素的配制激素配置方法见表B.1 。 表B.1 激素配置方法类别 名称 配制方法 灭菌方式 存储方式 生长素 2，4-