MRC-5体外培养细胞生长曲线测定 - 详细

1、MRC-5体外培养细胞生长曲线测定实验目的认识细胞接种和传代培养中细胞生长增殖规律。实验原理在培养接种或每一次传代培养过程中，培养物都要经历相似的恢复和生长过程。细 胞生长曲线反映的是培养细胞从接种到传代之前的生长状况，也是判定细胞活力的重要 指标。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，紧 接着进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然 后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生 长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平台期及退化衰亡4个部分。以 培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制细胞的

2、生长曲线坐标图。实验准备3.1实验人员用品工作服、帽子、口罩、手套、肥皂、医用手臂消毒桶、0.1%新洁尔灭消毒液；3.2消毒和灭菌用品电炉、高压蒸汽灭菌锅、铝盒、24孔细胞培养板、移液管、枪头、洗耳球、 离心管(规格：1.5mL/5mL/10mL)；3.3药品和试剂DMEM 细胞培养液(10%血清)、0.25%胰蛋白酶-0.53Mm EDTA、PBS(-)；3.4细胞MRC-5人二倍体细胞；3.5设备与器材CO2培养箱、离心机、移液枪(规格：1000uL、200uL)、二级生物安全柜、 血细胞计数板、显微镜、记号笔、废液瓶；实验步骤4.1细胞接种4.1.1选择生长良好的MRC-5人二倍体细胞，

3、移液管移除原细胞培养液至废液瓶中；4.1.2 DPBS润洗三次，每次5mL；4.1.3吸管吸取1mL胰蛋白酶溶液浸润培养层细胞，37C恒温消化210min；4.1.4用含10%血清的DMEM培养液4mL终止消化；4.1.5将终止消化后的细胞悬液用移液管转移至离心管中，1000r/min离心8min，弃上清；4.1.6吸管吸取2mLDMEM细胞培养液悬浮细胞；4.1.7对细胞悬浮液进行细胞计数；4.1.8调整悬浮液的细胞浓度分别为5X103个/mL(A)、2X104个/mL(B)、5X104个/mL(C)3种不同的细胞浓度(细胞理论数：1.575X 104个)；4.2细胞培养4.2.1依次将浓度

4、为5X103个/mL(A)、2X104个/mL(B)、5X104个/mL(C)的细胞悬液 分装于3个有盖的24孔细胞培养板，分别按每孔接种1mL，每种浓度各接21孔， 进行细胞的悬浮培养；4.3细胞换液细胞接种培养后，分别按照每间隔3d和5d换液一次。4.3.1吸管吸取细胞悬液并将其移入1.5mL离心管中，1000r/min离心8min；4.3.2离心后，用移液管将上清液移至废液瓶；4.3.3吸管吸取1mL新鲜的DMEM细胞培养液悬浮细胞，吹打混匀；4.3.4将离心管中的细胞悬液移入相应细胞培养板的培养孔中继续培养；4.4细胞生长计数每隔24小时计数一次，每次每个浓度各取3孔，细胞计数后取平均

5、数，如此 操作至第7d结束。4.4.1吸管吸取细胞悬液于已标记好的离心管中吹打混匀；4.4.2微量加样器取混匀后的细胞悬液100uL于1.5mL离心管中，加入100uL台盼兰混 合均匀，进行细胞染色2min；4.4.3将染色后的细胞悬液加于已盖好盖玻片的血细胞计数板的计数室；4.4.4显微观察：100倍的倒置显微镜下观察记录计数板4角大方格中的细胞数，细胞 压边线时，只记压上线和左边线者，将计数结果代入下式进行细胞密度计算。细胞密度：（个/mL） = （4个大方格细胞总数/4）X2X1044.5生长曲线绘制以培养时间（d）为横坐标，以细胞密度（个/mL）为纵坐标，绘制细胞生长曲线并 按下面的公

6、式计算细胞倍增时间。也2Td =；-lg Nt lgN0Td：细胞倍增时间；t :培养时间；Nt： Td时的细胞数；N0:接种后细胞数。注意事项：在制备细胞悬液时一定要匀速吹打，混合均匀，防止产生气泡；计数前细胞悬液制备（若细胞贴壁需进行）计数前，吸除培养孔内的培养液，PBS（-）洗3次，加入200uL细胞消化液，于37C、 5%CO2培养箱内消化310min min。用含10%血清的DMEM培养液800uL终止消化，轻 轻吹打均匀，制成单细胞悬液。预实验：1、细胞贴壁性验证制备细胞悬液（培养液为DMEM，细胞浓度为：5X104个/mL），吸取5 mL细胞悬 液于消毒后的T25细胞培养瓶，置于37C、5 % CO2培养箱中培养5天，每隔半天观察 细胞是否贴壁。2、细胞浓度调整：根据起始浓度进行浓度由大到小的浓度依次稀释，稀释完成一定要混匀后再分装。3、细胞生长情况预实验:1mL细胞悬液离心管另一种细胞生长曲线测定法：MTT法1 .制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0. 1 mL MTT于37C孵育4 h。使MTT还 原为蓝紫色甲月赞结晶。加1 mL DTW脱色液，37C至少