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文档简介

1、PEG诱导原生质体融合的机理：带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水 引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近 原生质体之间紧密接触。使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43- 形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负 电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。四、实验材料、试剂和仪器1.材料无菌烟草叶片、洋葱根尖五、2.试剂1)六、2)七、3)PEG 液：30%(w/v)PEG(MW=6000)CaCl2.2H2

2、O 0.01mol/LkH2PO40.00074mol/L山梨醇0.1 mol/L调pH 5.8-6.2；用时现配！八、2)一般实验用品大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离心管，小漏斗，不锈钢网300目.九、烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离-提纯原生质体并调整原生质体密度 .PEG法使原生质体融合倒置显微镜观察并照相实验步骤：取酶储液10ml，分别加入纤维素酶和果胶酶0.08g,0.1g，制备酶液。取材：烟草、洋葱根尖各0.7g取洋葱根尖，并将其切成0.5cm长短大小放入小平皿中;取烟草叶片将其剪成0.5cm2大 小放入小平皿中。酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入250c培养箱酶

3、解。洋葱约4h，烟 草约3h。观察酶解效果4.5 .原生质体的分离和纯化1）酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在10ml离心管 中。2）1000转/分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸走）。3）用CaCl2.2H2O （约1ml）悬浮下面的原生质体（PEG法）；电融合法则用电融合 液悬浮。4）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复1）3）操作。原生质体的密度测定用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至5*105 个/ml。原生质体的融合（一）PEG 法1）配制 PEG 液（5ml）30% （w/v） PEG（MW=6000）1.5 gCaCl2.2H2O0.0074gkH2PO40.0005 g0.0911g山梨醇调 pH 5.86.22）将两种原生质体悬液等量混合3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿78滴，每滴约0.1ml。然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应有35个平皿的重复）。4）用吸管将等量

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