QPCR详细实验过程和仪器操作说明

1、QPCR实验过程一、细胞培养1.1不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的 氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。1.2凝胶样品的灭菌处理将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖 过样品。然后密封，放入80C烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此 往复3-5次即可。1.2水凝胶样品的接板将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培 养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水 分和多余的

2、钙离子。然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗 3次，按每个孔 5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行 换液。二、PCR操作过程M-RNA的提取2.1细胞裂解将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml （实际 可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 C的冰 箱中至少冷冻12小时。M-RNA 提取2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与 氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例，即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s, 再冰上室温放置3分钟。

3、然后2-8 C，12000*g离心15min。离心后样品分为三 层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中， 水相体积约为所用TRizol试剂的60%。2.2.2把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。 此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 pl的水相，如果吸到红色无 机相，此样品重新进行上部离心。然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml 的异丙醇，在冰上放置10min。2.2.3剧烈混匀后2-8 C，12000*g离心10min，离心前看不到RNA沉淀，离心 后可能也看不到，属于正常现象。剧烈磕去上清

4、液。2.2.4加入75%的乙醇洗涤RNA。没1ml TRzol加入1 ml75%乙醇。2-8 C，不超 过7500*g离心5分钟，用力磕去上清液，然后在冰面上进行干燥30min.2.2.5加入40似的DEP水进行稀释，然后混匀，离心后备用。若不立即使用可 以存放在-80 C。三、逆转录操作过程本逆转录过程使用的是Thermo Scientific的K1622试剂盒。3.1按照操作说明书预先配好逆转录试剂前驱液(每个样品用量)加入引物为 Random Hexamer : 1 pl加入 5X Reaction Buffer : 4 pl加入 RiboLock RNase Inhibitor (20

5、 U/pl) : 1 pl加入 10 mM dNTP MiX : 2 pl加入 RevertAid M-MulV RT (200U/pl): 1 pl加入 Water， nulease-free : 3 pl加入 Template RNA : 8 pl1-6步骤可以多个样品同时配好，在分装。以上所有物质加在一起共20 pl反应 体系。(也可以参考试剂盒说明书)3.2逆转录过程及程序设计将3.1步的所有样品加入PCR小管子中，然后涡旋震荡30 s，再用小离心机离心30 s.然后将其放到PCR仪器中。3.3逆转录程序设置第一步：在25 C保温5 min，然后在42 C保温60 min，最后在70

6、C反应5min。(参照试剂盒说明书)3.4逆转录完成后取出样品，如不立即使用放置在-80 C。四、RT-PCR操作过程4.1反应体系配置具体配比按照下表(单个样品)：试剂名称使用量Bestar SybrGreen qPCR mastermix10 pl12.5 pl25 plPCR Forward Primer (10 pM)0.5 pl0.5 pl1 plPCR Reverse Primer (10 pM)0.5 pl0.5 pl1 plDNA模板1 pl1 pl2 plddH2O8.0 pl10.5 pl21 plTotal20 pl25 pl50 pl总反应体系选择为20 m，由于样品较

7、多，为了省时间和方便添加试剂，可以分 为三步走的方法。首先配置所有样品所需要的荧光染液，其次配置不同引物的各 自总含量，最后加入所需要的CDNA含量。（我实验选择的为20 m）4.2实验的布板将上述三种试剂加到PCR专用孔板中，然后封膜，不能有气泡。最后进行涡旋 混匀30 s，然后利用孔板离心机离心30 s。具体样品布板说明案例，以4个样品， 每个样品三个平行样，每个平行样分出两个样。共检测5个基因，一个内参基因。 具体布板如下图iSmpleGene 、.1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-3CollagenCollagenALPALPOCNOCNGAPDGA

8、PDSampleGene1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-3OPNOPNRUNRUNGAPDGAPD注意，加样品时要非常小心，避免出错，且孔板要在冰上，内参基因每个板子单 独存在。4.3三步法PCR扩增标准程序预变性95 C，2 min；PCR反应95 C，10 s;50-60 C，30-34 s; 40 cycles72 C，30 s；溶解曲线（判断特异性）95 C，1 min；55 C，1 min；55-98 C（10 sec/cycle 0.5 C/cycle） 86 cycles o五、仪器操作开机：先开电脑，然后开启PCR仪器电源，带出现DNA分子

9、链，按PCR仪器 中间按钮立刻打开舱门。然后开启相应程序，逆转录按照程序进行即可。PCR过程操作：打开程序后，确认参数，然后点击下一步；点击create，选择板 子，在sample位置选择Unknow，然后选择带有样品的板子（可以直接全选），最后对孔板进行命名，分为横向样品名称和纵向基因名称，然后保存程序文件， 点击运行，保存数据文件位置，然后开始PCR扩增程序，预计等待2-3个小时， 结束实验，取出样品。六、结果分析反应结束后确认PCR的扩增曲线和溶解曲线，进行PCR定量分析。七、实验注意事项7.1安全性主要实验使用的Trizol，氯仿、异丙醇、荧光染料等具有一定的挥发性和毒性，要戴 手套和口罩，以