多肽修饰的PEGMAGMA涂层构建方法研究报告

1、编号：2本科毕业论文多肽修饰的PEGMA-GMA涂层构建方法研究院系：化学化工系姓名：X丽学号：1033110152专业：化学年级：2010级指导教师：魏雨职称：讲师完成日期：2014年05月12日摘要聚乙二醇(PEG)聚合物因具有良好的亲水性和生物相容性而被广泛应用在聚合物膜、硅基材料外表和金属外表的防污以及防止蛋白质、细菌或微生物在聚合物膜外表的吸附和粘接。本文拟用偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，使甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA和聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)在四氢味喃与无水乙醇的混合溶液中以不同比例进展自由基聚合反响，并由氢核磁共振分析仪(1HNMR)检测合成的聚合物分子构造，进一步

2、制备能稳定存在于基材外表的可功能化涂层，通过与短肽RGD,REDV,YIGSR氨基反响后，将短肽固定在涂层外表，并完成对不同种多肽粘附性差异的表征。关键词：PEG共聚物；涂层构建；短肽AbstractPolyethyleneglycol(PEG)polymerduetohydrophilicityandexcellentbiopatibilityandiswidelyusedinthepolymerfilm,themetalsurfaceandtheanti-foulingmaterialandtopreventthesiliconsurfaceproteins,bacteriaormicro

3、organismsinthepolymerandbondingthemembranesurfaceadsorption.Thispaperusingazobisisobutyronitrile(AIBN)asaninitiator,sothatglycidylmethacrylate(GMA)andpolyethyleneglycolmethacrylate(PEGMA)inamixedsolutionoftetrahydrofuranandethanolinadifferentradicalpolymerizationratiobyprotonnuclearmagneticresonance

4、analyzer(1HNMR)andFouriertransforminfraredanalyzer(FTIR)detectingthemolecularstructureofsyntheticpolymers,canbestableinthefurtherpreparationofthebasecoatsurfacecanbefunctionalized,withtheshortpeptideRGD,REDV,afterYIGSRaminoreaction,thepeptidecoatingsurfaceisfixedandpletecharacterizationofthedifferen

5、tpolypeptidesadhesiondifferences.Keywords:PEGcopolymer;Coatingbuild;Shortpeptides目录引言1 TOC o 1-5 h z 研究背景1PEG修饰的材料外表阻抗蛋白质吸附机理1RGD,REDV,YIGSR三种多肽的特性2本文研究思路3 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 实验局部3仪器与试剂3主要仪器3主要试剂3PEG共聚物的合成4PEG共聚物涂层的构建5PET基底材料的处理52.2.3PEG共聚物涂层的制备52.4多肽的固定5固定多肽的PEG共聚物涂层构建5探究不同种类

6、多肽的粘附性差异7 HYPERLINK l bookmark12 o Current Document 结果与讨论7共聚物的氢核磁表征7涂层的构造8接枝前后多肽溶液的紫外表征9 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 结论与展望10结论10展望10参考文献11致谢12引言研究背景蛋白质是生命的物质根底，广泛地存在于生物体中，并且对生物体有着重要的功能。然而蛋白质一旦与人造生物材料外表接触，很容易发生吸附现象，对这些材料造成污染，影响生物材料的性能，有时甚至危及生命平安。体内植入材料外表的蛋白吸附会诱发体内的生物排异反响，导致血栓形成，细菌繁殖与感染1

7、。此外，在非生物体内应用中，材料外表的蛋白质吸附也有诸多危害，如在船舶航行过程中，会有大量的生物体如细菌、贝类、藻类等附着在船体外表上2-3，增大航行阻力，增加燃料消耗。在这些与人们生产生活密切相关的生物技术应用中所涉及的一个共性科学问题就是如何减少蛋白质的吸附。因此，研究具有阻抗蛋白质吸附性能的材料外表已成为国内外研究的热点，对材料外表阻抗蛋白质吸附机理的深入了解将对隐形眼镜、医用植入材料、船体涂料、药物传递系统、生物芯片等应用起非常重要的指导作用。聚乙二醇(PEG)又称聚氧乙烯(PEO),是一种非枝化水溶性高分子化合物，其分子量分布X围很广；PEG(PEO)完全溶于水，并能与很多物质相容，

8、有很好的稳定性和润滑性，低毒且无刺激性。PEG(PEO)具有独特、有效的抗蛋白质吸附或血液相容的能力。在目前被采用的抗污染材料中，PEG(PEO)的应用最为广泛，抗污染效果最好。因而，PEG(PEO)常被作为“标尺，衡量其他材料的抗污染性能。由于PEG(PEO)及其衍生物具有优良的抑制蛋白质吸附性能以及生物相容性，研究者们尝试了大量方法把PEG(PEO)及其衍生物用于材料的外表改性。课题组4-7以含PEO的两亲性嵌段共聚物Pluronic(PEO-PPO-PEO)为改性剂，基于外表偏析原理构建抗污染超滤膜，发现成膜过程亲水PEO段自发富集在膜外表，而疏水PPO段起到很好的锚定作用，实现了蛋白质

9、在膜外表的超低吸附甚至“零吸附和纯水清洗下通量恢复率接近100%。PEG修饰的材料外表阻抗蛋白质吸附机理研究发现，材料外表的化学组成、亲疏水性、外表电荷、形貌构造等因素对蛋白质在材料外表的吸附行为具有较大的影响8。目前，对于材料外表阻抗蛋白吸附的机理主要有水化层理论、空间位阻理论，下面就本实验涉及到的空间位阻理论加以说明。StableUftstabke图1PEG抗蛋白质污染的空间位阻效应示意图最初的抗污染机理是人们基于对PEG抗污染性质研究的逐步深入而建立的。如前所述，PEG是常见的具有优异抗蛋白质吸附性能的聚合物。PEG分子的抗污染机理通常用空间阻力模型来解释。这种模型认为，PEG分子能迅速

10、形成水化聚合物链，具有很大的排除体积，从而防止蛋白质到达PEG外表。当蛋白质分子接触PEG外表并发生粘附时，会在较大程度上压缩PEG链的排除体积，PEG分子构象受到限制，是一种嫡减的不稳定状态如图1所示。实验和分子模拟证明PEG的抗污染能力取决于PEG链在材料外表的密度和长度9-10。RGD,REDV,YIGSR三种多肽的特性RGD三肽（精氨酸-甘氨酸-大冬氨酸）是许多细胞膜和ECM中所共有的细胞间识别的最小序列，而这一序列在介导细胞粘附和铺展方面起着非常重要的作用11。Klok等12通过聚合物刷将RGD短肽固定在外表后发现内皮细胞的粘附得到很大的改善。Holland等13将RGD和纤连蛋白分

11、别固定于聚苯乙烯上研究了人脐静脉内皮细胞的生长情况，发现经RGD和纤连蛋白修饰的外表内皮细胞相容性均有显著提高，而且RGD修饰的外表细胞粘附、生长更加良好。Hubbell等14发现，REDV短肽序列可以选择性的增强内皮细胞粘附机制，这种粘附作用不同于整合素介导的细胞粘附机制，具有内皮细胞特异性。Hubbell等15研究了人脐静脉内皮细胞在接枝固定了REDV短肽片段的基材外表的粘附和铺展行为，发现4小时后REDV接枝外表内皮细胞的铺展率要强于RGD。.Hodde等16研究了分别经RGD,REDV,LDV和PHSRN序列预处理的猪细胞外基质膜对人微血管内皮细胞粘附率的影响，发现只有RGD和REDV

12、序列可以有效地调节内皮细胞在猪细胞外基质膜外表的粘附。本文研究思路本文拟用偶氮二异丁月青作为引发剂，使甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯在四氢吠喃与无水乙醇的混合溶液中进展自由基聚合，进一步制备能稳定存在于PET基材外表的可功能化涂层，通过与短肽RGD,REDV,YIGSR进展氨基反响后，将短肽固定在涂层外表，从而构建了一种对细胞具有特异性粘附的生物活性外表，并对三种多肽粘附性差异的进展了相关表征。2实验局部仪器与试剂主要仪器表1主要仪器设备序号设备名称型号生产J家1集热式恒温加热磁力拌器DF-101S巩义巾英峪华仪器厂制造2循环水式真空泵SHZ-Dem巩义巾英峪华仪器厂制造3紫外分光

13、光度计722XX佑科仪器仪表XX4傅里叶变换红外光谱仪BrukerTensor27德国Bruker公司5氢核磁共振分析仪BrukerAm400MHz德国Bruker公司主要试剂表2主要试剂序号试齐型号生产厂家1聚乙二醇甲基丙烯酸酯分析纯XX亚科化学试剂制造XX2甲基丙烯酸缩水甘油酯分析纯XX亚科化学试剂制造XX3偶氮二异丁睛分析纯XX亚科化学试剂制造XX4四氢吠喃分析纯XX巾富宇精细化工XX5无水乙醇分析纯XX市双双化工XX6无水乙醛分析纯XX市双双化工XX7硫酸分析纯XX昊化化学试剂XX8过氧化氢分析纯XX市凯XX学试剂XX91,6-己二胺分析纯XX亚科化学试剂制造XX10氯化钠分析纯XX市

14、恒兴化学试剂制造XX11氯化钾分析纯XX市恒兴化学试剂制造XX12磷酸二氢钾分析纯XX市恒兴化学试剂制造XX13磷酸氢二钠分析纯XX市恒兴化学试剂制造XX14多肽RGD分析纯吉尔生化XXXX15多肽REDV分析纯吉尔生化XXXX16多肽YIGSR分析纯吉尔生化XXXXPEG共聚物的合成本实验中共聚物的合成，主要是利用PEGMA和GMA在引发剂AIBN的作用下聚合制得的。实验主要步骤：首先通过抽烤的方法对装置除水除氧，然后将单体溶解注入到密封装置，在60c下恒温振荡反响16h,反响产物用旋转蒸发仪浓缩至3-5mL,浓缩后的溶液用冰乙醴进展沉析，产物经抽滤，真空枯燥保存备用CH3反响原理如图2所示

15、，两种单体按不同投料比所得产物的量见下表表CH3CH3 IH2C = C I C = OH2C = CO=CAIBNH2 a CC=OO H2CC、oS3H2H2O= C- OfCH3OCH2H220图2PEGMA与GMA反响的化学方程式表3PEGMA与GMA按不同投料比所得产物的量PEGMA质量gGMA质量gAIBN的质量gn(PEGMA):n(GMA)产物质量g10.96510.29710.0248120.375120.96050.15100.0206110.268531.91390.15570.0422210.8999PEG共聚物涂层的构建PET基底材料的处理医用PET膜：依次用丙酮、甲

16、醇和三蒸水超声处理10分钟，最后用三蒸水洗净。N2吹干，保存备用。取适量1,6-己二胺固体溶解于无水乙醇中，配制成10%的溶液，将预先处理好的PET膜片浸入到10%的1,6-己二胺溶液中，并在低温下反响24h然后用三蒸水冲洗3遍，N2吹干，保存备用。处理前后的膜片比拟见图3图3PET氨基化处理前后的膜片PEG共聚物涂层的制备仿生涂层的浸涂法制备：配制浓度为1mg/mL的聚合物-四氢吠喃涂层液，将已经处理过的玻璃片或PET薄膜浸入所配制的溶液中，并在低温下反响24h,然后用银子将膜片匀速提起，在空气中静置一段时间，待THF挥发后，真空枯燥成膜，放在真空枯燥箱中保存备用。接枝聚合物前后膜片的比拟见

17、图4o图4接枝聚合物前后膜片的变化多肽的固定固定多肽的PEG共聚物涂层的构建(PBS缓冲溶液PH=7.4的配制分别称取磷酸二氢钾0.048g磷酸氢二钠0.288g氯化钠1.64氯化钾0.04g,置于500mL的烧杯中，用200mL三蒸水进展溶解，溶解完全后，用微孔滤膜进展过滤至离心管中，低温保存备用。(2)多肽溶液500Ng/mPBS缓冲液，pH7.4的配制准确称量三种多肽固体RGD(0.005g),REDV(0.005g),YIGSR(0.004g)分别参加10ml的PBS缓冲液溶解，溶解完全后，取出2ml溶液用做标准曲线，剩余液体低温保存备用。(3)制备多肽修饰的PEG共聚物涂层首先将涂覆

18、聚合物的PET膜片剪成一样大小，长宽均为18mm然后分别浸入到短肽RGD、短肽REDV和短肽YIGSR溶液中，低温下反响24h。再用银子取出，PBS溶液冲洗外表数次后常温枯燥。接枝多肽的主要操作内容见表4,接枝多肽前后膜片的比拟见图5。表4接枝多肽的主要操作内容固体多肽的PEG共聚物涂层的制备RGDREDVYIGSRPEGMA:GMA=1:13片3片3片1:23片3片3片2:13片3片3片GMA自身聚合3片3片3片图5接枝多肽前后膜片的变化探究不同种类多肽的粘附性差异通过紫外分光光度计测定出多肽溶液的标准曲线，然后测定与PEG聚合物反响前后多肽溶液吸光度A值的变化。由吸光度A值的变化依据标准曲

19、线可得出多肽溶液浓度的变化Ac,进而得出反响前后多肽溶液的变化量Am,因而可以分别计算出三种不同的多肽分子与PEG聚合反响的程度，即可得出不同种多肽粘附性的差异表5。表5多肽外表粘附性差异的表征多肽外表粘附性差异的表征RGDREDVYIGSR与PEG聚合物反响前多肽溶液的浓度Co500g/ml500g/ml400g/ml与PEG聚合物反响前多肽溶液的吸光度AAiA2A3与PEG聚合物反响后多肽溶液的吸光度AAiA2A3与PEG聚合物反响后多肽溶液的浓度cCiC2C33结果与讨论本章主要是对制备的PEG共聚物进展氢核磁表征，并对三种不同多肽在PEG聚合物涂层外表的接枝情况进展测定。PEG共聚物的

20、氢核磁表征核磁共振波谱是物质与电磁波相互作用而产生的，属于吸收光谱波谱X畴。根据核磁共振波谱图上共振峰的位置、强度和精细构造可以研究分子构造。本实验将聚合物用笊代氯仿溶解，配制成一定浓度的溶液，并用氢核磁共振分析仪对产品进展氢核磁表征见图6。H CeCo = c -OCH3H3C C图6PEGMA-GMA聚合物的氢核磁共振谱图共聚物由聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸缩水甘油酯单体构成，由氢核磁共振谱图可以看出：6a=4.302HCOOCH2),从聚合物的构造来看，亚甲基因与酯基相连，向低场移动，位移变大。1=3.6080H,-CH2-CH2-O-，此处吸收峰强度最强，明显可以看出是氧乙烯长

21、链的吸收峰，而6=3.38(3H,OCH3),也可以看出是与氧乙烯长链相连的甲基的吸收峰。综合这三组吸收峰，我们可以知道反响最终合成了想要得到的聚合物。涂层构造实验中，通过化学接枝的方法先将PEG聚合物引入到涂层外表，然后利用聚合物上的环氧基团与多肽中的氨基发生开环反响将多肽引入到涂层外表，这就构建了一种对内皮细胞具有特异性吸附的生物活性外表，它兼具了PEG抗蛋白吸附的性能，同时能实现对内皮细胞的特异性吸附，RGD,REDV,YIGSR三种多肽的涂层构造见图7a,b,Gabc图7涂层构造接枝前后多肽溶液的紫外表征通过紫外可见分光光度计分别测定出多肽RGD,多肽REDV,多肽YIGSR与聚合物反

22、响前后的紫外吸收曲线见图8,从图中可以看出三种多肽的最大吸收峰位置相近，都在280nm左右，但在最大吸收峰处吸光度值有一定的差异，这可能与其自身构造有一定的关系。利用多肽溶液反响前后吸光度的差值，依据标准曲线，可以知道反响前后多肽溶液的浓度对应也有一个差值，同时反响前后体积不变，因而可以计算出与聚合物反响的多肽溶液的量，即可比拟出三种多肽粘附性的大小（见表6）。abc图8三种多肽溶液与聚合物反响前后的紫外吸收曲线表6三种多肽粘附性大小的比拟变量多/AAAm(单位：mg)Am/S单位：g2dmRGD1.5031.2572.46431.69REDV1.5101.2662.37230.51YIGSR

23、1.5731.3052.25729.03由表6可以看出三种多肽都能在聚合物涂层外表发生吸附，且吸附量相近。但与实际吸附量相比，可能存在一定的误差，这主要来自两个方面：一是涂层外表固定多肽的过程中，取出膜片的时候，不可防止地会将一局部多肽溶液带出，造成溶液的损失。二是所使用的紫外分光光度计运行时不是太稳定，测量的数据存在一定的误差。4结论与展望结论(1)本文首先通过用偶氮二异丁月青作为引发剂，使聚乙二醇甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯在四氢吠喃与乙醇的混合溶液中发生自由基聚合反响，并由氢核磁共振分析仪(1HNMR)对合成的聚合物分子构造进展了表征，1HNMR结果证实了聚合物的构造。进一步通过化

24、学接枝反响将聚合物引入到PET基材外表，最后利用多肽的氨基反响将三种多肽RGD,REDV,YIGSR固定到涂层外表，从而构建了一种对细胞具有特异性吸附的生物活性外表。(2)通过紫外表征可知，这三种多肽RGD,REDV,YIGSR均能在PEG聚合物涂层外表发生化学接枝反响，并且他们的接枝量相近，也就是说他们之间的粘附性存在一定的差异但并不是很明显，这可能与他们自身的构造有一定的关系。这对于探索出其他种类的多肽修饰的聚合物涂层外表有一定的启示意义。展望聚乙二醇聚合物表现出来的良好的亲水性和生物相容性，使其可以广泛应用在生物金属材料外表改性等方面。但是PEG在有氧气和过渡金属离子存在的情况下，容易发

25、生自动氧化170这就需要更好地优化反响条件，选择适宜的修饰产物，适宜的PEG,对蛋白质和多肽进展定点修饰。如何使材料外表不受或者尽可能少受到生物污染，制备性能优良的阻抗蛋白质吸附材料，这将成为当今生物医用材料、生化别离、船体涂层材料等领域的研究热点和难点。参考文献HerrwerthS,EckW,ReinhardtS,etal.Factorsthatdeterminetheproteinresistanceofoligoetherself-assembledmonolayers-internalhydrophilicity,terminalHydrophilicity,andlateralpac

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