生物化学实验技术-PowerPointPresenta

1、生物化学实验技术1生物化学实验技术实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量实 验三 、血清-球蛋白的分离与纯化实 验四、碱性磷酸酶Km值测定实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析实 验七、 SGPT活性测定实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶实 验九 、RNA的分离与鉴定实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质实 验十一、 质粒的提取与鉴定2实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 3【目的要求】掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。4【实验器材】中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴

2、箱，721型分光光度计5【方法步骤】取中试管3支，按下表操作。试剂（ml） 标准管 样品管 空白管 蛋白质标准待测液蒸馏水双缩脲试剂0.15.0 0.1 5.0 0.1 5.0 6各管混匀、放置37水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 7【注意事项】1正确使用微量加样器。2取液要准确。3. 做好标记，不要将试管号弄混。 8【思考题】1分光光度计的使用及计算原理。9实 验二紫外分光光度法测定蛋白质含量10【目的要求】了解分光光度法的基本原理；能较熟练使用紫外分光光度计。11【实验器材】1紫外分光光度计。2微量加样器。3蛋白标准液（1mg/ml）。 12【方法步

3、骤】1标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓度为1mg/ml的蛋白质溶液。2标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作13管号 123456蛋白标准液（ml） 生理盐水（ml） 0.53.51.03.01.52.52.02.02.51.54.014混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白质的浓度为横坐标绘制标准曲线。3标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混匀，按上述方法测其吸光度。15【结果与

4、分析】1根据标准曲线查出蛋白质浓度。2也可利用经验公式计算蛋白质含量；适当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质浓度。如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度（mg/ml）1.45A2800.74A260。16【注意事项】1加量要准确。2比色皿的正确应用。3结果重复3次，取平均值。17【思考题】1为何要同时测定蛋白280nm和260nm处的光吸收值？18 （一） 血清-球蛋白的分离与纯化实验三191掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2熟悉盐析和层析的基本操作；3 掌握离心机的正确使用方法。【实验目的】20【仪器试剂】 试管、刻度吸管、吸耳球、胶头

5、滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸铵溶液。21 【实验原理 】1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素电荷(同种电荷相斥）水化膜（隔离）Pr+Pr+中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。22中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀蛋白质的方法还有哪些？23（2）盐析的影响因素蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH值、温

6、度等。 本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解，-球蛋白在33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。 242.层析： 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。253.检测分离效果（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与其呈现红色或紫红色。261盐析 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10分钟，倾上清液（上清

7、中主要含清蛋白）。 【实验操作】27 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟（注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖子盖好）。倾上清液（上清中主要含、球蛋白），沉淀即为初步纯化的-球蛋白。28 装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/33/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。 2.脱盐：注意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整 29（2）加样：向装有-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴，用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸出-球蛋白液

8、，加到层析柱内凝胶表面。待-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至凝胶面以下。 30（3）收集：加样同时可进行收集，每管收集1ml。收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶和尼龙布等。 检测：准备反应板两块。将12管收集液各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用、号表示有无呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。31【实验结果】可用、号表示有无呈色或颜色深浅。将双色脲反

9、应呈色最深的一管收集液保留供下次实验使用。利用醋酸纤维素薄膜电泳检测本次实验所提-球蛋白的纯度。321使用离心机前注意配平；2装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整；3凝胶高度要在柱高的1/33/4之间；4脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下；5实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。【实验注意事项】33【思考题】1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？2. 盐析与变性的异同？3凝胶层析的原理？34（二） 血清-蛋白的鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳351. 掌握电泳的基本原理；2. 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和 应用。 【实验目的】36【仪器试剂】 电泳仪、点样器、镊子、

10、醋酸纤维素薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗掖。37 【实验原理 】1.蛋白质是两性电解质，在同一个PH 环境下，混合蛋白质中各种成分带电量不同、分子大小不同，在同一电场中泳动的速度不同，导致相同的时间迁移的距离不同而把它们分开。（1）分子越小，泳动速度越快（2）带电量越多，泳动速度越快反之，越慢。382.本实验分离全血清中各种蛋白质成分，同时鉴定上次实验提纯结果。 点样 2 1 清蛋白球蛋白391. 准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样，即上述实验得到的-蛋白，另取薄膜一点全血清。 2. 电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电压110V，通电40-45

11、min；3染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。【实验操作】40【实验结果】根据电泳区带出现的位置和条数判断是何种血清蛋白，如果只是一条-蛋白说明上个实验分离纯化的较好。411不要用手触摸纤维素膜；2注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛 面；3点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘 太近，不要重复点样；4膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极；【实验注意事项】42【思考题】 如果电泳结果证实球蛋白的分离效果不理想，应从哪些方面分析？43实 验 四碱性磷酸酶Km值测定44【目的要求】了解酶促反应的影响因素；掌握Km的意义和测定方法；了解底物浓度与酶活性的关系。45【实验器材】1

12、可见分光光度计。2微量加样器。30.025U/ml的酶液。46【方法步骤】1取干净试管8支，按下表正确操作： 47试剂123456780.02M基质液蒸馏水碳酸盐缓冲液 0.11.31.50.21.21.50.31.11.50.41.01.50.60.81.50.80.61.51.41.51.41.5 混匀置37水浴保温5分钟 酚标准液 酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1 充分混匀置37水浴准确保温15分钟 0.5铁氰化钾 2.02.02.02.02.02.02.02.048充分混匀后置室温10min，510nm波长下进行比色，以第8管做空白，测定各管的光密度。【结果与分析】

13、1计算各管酶活性单位。 D测/D标0.012计算各管S。 S加入S量/3.00.023进一步计算出各管1/V和1/S。4将上述数据填入下表49以1/S为横坐标，1/V为纵坐标，画出各管的坐标点，并将其连成直线，此直线与横轴的相交点为-1/Km，由此可计算出该酶的Km。50【注意事项】1本实验所用各种玻璃仪器必须洗净烤干后备用。2各种试剂的加入量要准确。3严格掌握加入酶液后的保温时间，否则会影响其 产物量的准确度 51【思考题】1为何可以酶活性单位代表酶促反应速度？2酶促反应的影响因素有哪些？3何为Km值？如何测定一个酶的Km值？52Folin-Wu法实验五 胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响53

14、1.掌握影响血糖含量的因素；2.熟悉测定血糖的原理和方法及临床意义；3.熟悉动物取血的基本操作。【实验目的】54【仪器试剂】 722型可见光分光光度计、血糖管、奥氏吸管、锥形瓶、注射器等；钨酸钠、浓硫酸、磷钼酸、碱性铜等。用于吸抗凝血,中间为膨大的球体,减少血液和吸管壁的接触面积,尽量避免融血.55 【实验原理 】主要调节激素降低血糖：胰岛素升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、糖皮质激素、肾上腺素1.体内血糖水平主要依靠激素的调节 胰岛素(insulin)： 体内唯一降低血糖水平的激素 肾上腺素：主要在应激状态下发挥调节作用。 562.无蛋白血滤液的制备原理本实验采用吴宪氏法测定血糖，要

15、求将血液制成无蛋白血滤液：?2RCOOHNH2+ H2WO4RCOOHNH2WO42此方法是生物碱沉淀蛋白质沉淀蛋白质的方法还有哪些？573.利用吴宪氏法测定血糖的原理G + Cu2+OH-Cu2O+糖氧化物3Cu2O+3H3PO4.2MO3.12H2O6CuO +3H3PO4.2MO2O3.12H2O钼蓝通过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！581动物准备 取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重（一般为23kg）。2取血 以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳， 使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺破静脉放血，将血液收入抗凝管中（按10：1的比例将防凝剂放入试管，边收集（量约3ml）

16、边摇匀，以防凝固。 用干棉球压迫血管止血。【实验操作】593注射激素后取血(1)取饿兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰岛素，剂量按0.75u/kg体重计算，并记录注射时间。一小时后再取血。取血后立即腹腔或皮下注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性休克而死亡。(2)另一只兔腹部皮下注射肾上腺素，剂量按0.4mg/kg体重计算，并记录注射时间。半小时后再取血。60 用干燥的奥氏吸管吸防凝血1ml，擦去管尖外面的血液后，慢慢地放于干燥的锥形瓶中,然后吸硫酸8ml,慢慢地加入，随加随摇（不能有气泡产生），此时溶液逐渐变为深棕色，再沿锥形瓶壁加入钨酸钠1ml，随加随摇以充分沉淀蛋白质，混匀后，放

17、置5分钟，然后以2500rpm离心5分钟，倒出上清夜待血糖测定用，此液即无蛋白血滤液。4.无蛋白血滤液的制备：615.血糖值的测定 取中试管五支，分别标记，按下表操作 试 剂 空白管 标准管 胰前 胰后 肾前 肾后 无蛋白血滤液 0.5 0.5 0.5 0.5 G标准液 0.5 蒸馏水 0.5 碱性铜 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，放入冷水浴中冷却。切勿摇动血糖管。各加入磷钼酸试剂0.5ml，混匀，放置10分钟，各加蒸馏水5ml，用420nm波长比色，以空白调零，读取各管光密度.62【实验结果计算】葡萄糖（mmol/L）=OD测定/OD标准 0.

18、5 10正常值：3.96.1mmol/L（人） 兔比人略低。C标准稀释的倍数631. 制备无蛋白血滤液过程中，用奥氏吸管吸取全血，将吸管外壁的血液擦除干净后插入蒸馏水底层，缓缓放出血液，再用上层液将内壁的血液冲洗干净。2. 加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀。3. 沸水浴和冷水浴过程中，切勿摇动。 【实验注意事项】64【思考题】1.为什么测定血糖时必须预先出去蛋白质？2.为什么选用奥氏吸管吸取血液？3.为什么用操作中不要摇动血糖管？65胰岛素 促进葡萄糖转运进入肝外细胞 ； 加速糖原合成，抑制糖原分解； 加快糖的有氧氧化； 抑制肝内糖异生； 减少脂肪动员。 体内唯一降低血糖水平的激素 胰岛素的作用

19、机制:66实验六 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析【目的要求】1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。2.掌握血浆脂蛋白的分类。 67【实验器材】1.仪器与材料： 玻璃片，5ml刻度吸量管， 滤纸片，打槽器，20l微量加样器，电泳仪。2试剂： 苏丹黑B染色液，巴比妥缓冲液，凝胶缓冲液，琼脂糖凝胶。3样品： 血清68【方法与步骤】1.制板:取玻璃片放到平整的桌面上，用刻度吸量管吸取溶化的琼脂糖约2.52.8ml加到玻璃片上。2.挖槽：5分钟后，在离凝胶板一端约1.5厘米处打一个101mm的小槽，用压扁的针头将槽内凝胶清除，然后用滤纸片将槽内的水吸干。69【方法与步骤】3.加样:于琼脂糖凝胶槽内加入预染好

20、的血清20l。4.电泳:将加好样品的琼脂糖凝胶板置于电泳槽支架上，样品端靠近阴极，再用双层纱布搭桥，平衡35分钟，然后通电，电压为80100v，电泳时间为4060分钟。70【结果与分析】 -脂蛋白位于最前，-脂蛋白位于最后，中间为前-脂蛋白，空腹血清无乳糜微粒，进食后血清可出现乳糜微粒位于原点。 71【注意事项】1.制板要均匀。2.挖槽要整齐,不能太宽。3.电泳电压要保持稳定。72【思考题】1.琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？73实验七 SGPT活性测定【目的要求】掌握SGPT活性测定的原理。熟悉SGPT活性测定的临床意义。74【实验器材】1仪器与材料 : 中试管3支，l毫升刻度吸管2支，5升刻度

21、吸管1支，100l微量加样器，水浴箱，721型分光光度计。2试剂: 丙酮酸标准液，SGPT基质液，0.1MpH7.4磷酸盐缓冲液，2、4-二硝基苯肼溶液，0.4mol/LnaOH溶液。3样品: 血清75【方法与步骤】 取中试管3支，按下表操作。 标准管 样品管 空白管 血清（ml） 0.1 0.1 丙酮酸标准液（ml） 0.1 SGPT基质液（ml） 0.5 0.5 混匀后，37水浴箱30分钟，76【方法与步骤】 标准管 样品管 空白管2、4-二硝基苯肼（ml） 0.5 0.5 0.5SGPT基质液（ml） 0.5 混匀后，37水浴箱30分钟，0.4mol/LNaOH （ml） 5.0 5.0

22、 5.077【方法与步骤】将各管混匀后静置10分钟，然后用721型分光光度计500nm波长比色，以空白管调零，读取光密度值，计算。SGPT =测定管光密度标准管光密度20 2.50.11178【结果与分析】正常值为2-40单位注：1个SGPT单位相当于1ml血清37，30分钟产生2.5ug丙酮酸。79【注意事项】1试剂量、保温时间要准确。2测定时间尽量短。80【思考题】1SGPT测定有何临床意义?81聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶实验八82【目的要求】掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。83聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acr

23、ylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。【实验原理】84

24、聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；85(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。86凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范

25、围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.687聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。 88图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)89乳酸脱氢酶（LDH）是葡萄糖酵解过程中很重要的一种酶，该酶催化丙酮酸和乳酸的相互转化。LDH目前发现有五种同工酶。在碱性条件下，

26、五种LDH同工酶都带负电荷，电泳时都向正极移动。由于各种同工酶的pI不同，在同一pH条件下带电荷多少不同，电泳速度即不同，故可用电泳法将其分离。按电泳速度的快慢依次为ODLDH1、ODLDH2、ODLDH3、ODLDH4、ODLDH590将LDH同工酶电泳分离后进行染色，以显示各种同工酶的位置。其染色的原理是： 乳酸 丙酮酸 NAD+ NADH+H+ PMSH2 PMS NBT(无色) NBTH2(紫蓝色) 91【实验器材】仪器 与材料 真空泵、圆盘电泳槽、电泳仪、刻度吸管、微量加样器、长头注射器、烧杯等。试剂 30丙烯酰胺贮存液、催化剂1过硫酸铵、1TEMED缓冲液、电泳槽缓冲液、蔗糖、乳酸

27、钠、辅酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液样品 血清92【方法与步骤】1. 准备玻璃管：准备560mm玻璃管若干支，洗净烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。93试 剂用 量TEMED缓冲液 30%Acr-Bis溶液 蒸馏水 1.5ml 4ml 6ml 混匀真空抽气5分钟0.14%过硫酸铵 合 计6ml 17.5ml2. 配制凝胶：943. 装管：用细长滴管或长头注射器吸取凝胶装入玻璃管中，高度距离管上口8mm为宜，检查管内无气泡后，向胶面缓缓注入蒸馏水约4mm高度，在自然光下聚合约40分钟，见水与胶之间有明显界面出现，为胶已聚合。用滤纸条吸取凝胶上方水层，取下管底部的橡皮套管

28、，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致。95 4. 加样：用微量加样器每管加血清蔗糖稀释液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，溴酚兰少许混合而成）。用电极缓冲液将胶管顶端注满，小心避免样品混合。在上下槽中加入电极缓冲液，上槽应漫过胶管上口。96 5. 电泳：接通电源，负极接上槽，正极接下槽，调电流2.5mA/管或调电压200V，保持电压稳定。等染料迁移到距凝胶下口约5mm处时，停止电泳。时间约2小时。 976. 出胶：用长头注射器吸满水，将针头小心插入凝胶与玻管壁之间，边推水边旋转胶管，凝胶柱即可脱出。将每条胶柱放入小试管内。7. 染色：管内加染色液，放37水浴保温待淡紫色区带

29、出现（约30分钟）。倒出染色液并用水洗去凝胶柱表面染色液，加入醋酸溶液以终止酶促反应。 988.百分含量扫描测：将分离的LDH同工酶凝胶柱用薄层层析扫描仪在560nm波长处扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。计算方法：总光密度：T=ODLDH1+ODLDH2+ODLDH3+ODLDH4+ODLDH599【结果与分析】 正常人血清LDH各同工酶活力百分比是：LDHl 33.4；LDH2 42.8；LDH3 18.5；LDH4 3.9；LDH5 l.4。不同方法测定值略有不同。100【注意事项】 所用器材必须清洁。特别是制备凝胶柱所用的玻璃管每次用后必须用洗液浸泡，再常规清洗，否则

30、凝胶剥离困难。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，应避免直接接触。电泳完毕后，上下槽电极缓冲液不可混合，因离子强度和pH值都已发生改变。101【思考题】LDH同工酶测定的临床意义是什么 102实验九 RNA的分离与鉴定103【目的要求】1掌握RNA分离纯化的原理及操作方法2熟悉台式离心机的使用3. 掌握RNA定量技术104【实验器材】1、仪器与材料 离心机一台,组织捣碎机一台，手术器械1套，天平1台。2、药品 0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA匀浆缓冲液，氯仿-异戊醇混合液，RNA标准液，95冷乙醇，地衣酚，3、动物 家兔，体重2.50.5kg。 105

31、【方法步骤】1.选取健康家兔一只，断头处死，取其肝脏，称取25g，放入组织捣碎机中，加入预冷的0.14mol/L NaCl-0.15mol/LEDTA匀浆缓冲液约130ml，高速研磨2分钟，加缓冲液至200ml，即为肝匀浆。2. 分离核蛋白：肝匀浆4ml倒入试管中，3000rpm离心20min，上清倒入另一试管中为A管（RNP提取液），沉淀弃去。1063. A管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡2分钟，3000rpm离心15min，管内液体分三层，上层为含有RNA的水溶液，吸取上层水溶液转入B管中。4于B管加二倍体积的95冷乙醇，见乳白色RNA沉淀，混匀放置10min，3000rpm离心5

32、min，沉淀为纯化RNA。1075RNA的溶解：沉淀中加入0.14 mol/L NaCl 2.0ml，搅拌溶解，2000rpm离心10min，上清液则为RNA水解液。4ml 肝匀浆(已加0.14mol/L NaCl)6RNA的测定：按表2操作。108混匀，沸水浴10分钟，取出冷却，以空白管调零，在670nm比色，读取光密度值，计算。109【注意事项】1.在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行。2.各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。110【思考题】1.比较讨论氯仿-异戊醇混合液， 95冷乙醇有何作用？2. 为什么实验最后鉴定的是戊糖而不是其他的物质，戊糖的含量可

33、以代替RNA的含量吗？111实验十DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 112【目的要求】 掌握DEAE 纤维素离子交换层析法的基本原理 掌握其实际操作过程，包括装柱、洗脱、测定等步骤熟悉DEAE 纤维素离子交换剂的结构及特点了解梯度洗脱的原理113【实验器材】 仪器与材料 试管、烧杯、玻璃搅棒、层析柱、梯度洗脱仪等药品 DEAE纤维素-22(纤维素DE22)、0.5mol/L HCL 、0.5mol/L NaOH 、0.01MNa2HP04 、0.5MNa2HP04 114【方法与步骤】 DEAE-22 纤维素处理 装柱 安装梯度发生器 加样 洗脱 检测 115DEAE-22 纤维素处理

34、 称取DEAE-22纤维素2.5克先用40ml 0.5mol/L HCL浸泡30分钟,加蒸馏水60ml反复洗涤,使上层液体没有细的混悬物,然后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH4止再用40ml 0.5mol/L NaOH浸泡30分钟,倾弃上清液,加蒸馏水100m1,搅拌后,倒入有细尼龙布的漏斗中,用蒸馏水充分洗涤,直到流出液的pH8时，滤去水分将上述纤维素放入烧杯中,加入0.01MNa2HP04 100 m1,浸泡并搅动，放置5分钟，倾去上层液体,必要时再重复操作,直到溶液pH=8止116装柱 用螺旋夹扭紧层析柱下端胶管，把层析柱夹在铁支架上柱中加数毫升 0.0

35、1 MNa2HP04 液，然后打开出口，排出气泡，待柱中液体只剩下约 1cm 高时关闭出口将处理好的DEAE纤维素混悬液用吸管连续移入层析柱内，拧松下口的螺旋夹，使液体滴下全加到柱内后，待液面接近纤维素顶上界面时，把出口螺旋拧紧117安装梯度发生器 将梯度发生器两筒间及出口胶管的螺旋夹都拧紧，向有出口侧的筒内加入0.01M Na2HP04液40 m1，另一筒内加 0.5M Na2HP04液40 m1把此梯度发生器放到磁力搅拌器上，搅拌子放在出口侧的盛液筒中，使梯度发生器出口细胶管内充满掖体，排出气泡。扭紧螺旋夹，细胶管下端边到层析柱上口的胶塞上的连接管上 118加样 用吸管接近床面的位置上缓慢

36、加入血清 0.5 m1，打开下口让液体缓慢流出，流速每分钟5-10滴到全部血清恰好注入床面时，立即小心的加入 0.01M Na2HP04液0.5m1, 当液面接近床面时，拧紧下口螺旋夹，并把下口的胶管连接到自动收集器的收集管上 119洗脱 拧松梯度发生器两盛液筒间的螺旋夹，开动磁力搅拌器。将连接梯度发生器两口的细胶管连接到层析柱上端胶塞连接管上， 使液体流入层析柱内扭松层析下端胶管的螺旋夹，控制流速约50 滴 / 分，每收集管收集量约为 40 m1时换管，直到收集完为止120检测 用紫外分光光度计测读各管的 280nm 的吸光度，以吸光度为纵坐标 , 管号为横坐标 , 用方格坐标纸绘出血清蛋白层析谱观察判断结果 121【结果与分析】 不同管号中的蛋白质溶液，吸光度各异，随着管号增加，吸光度先逐渐升高然后逐渐降低这表明经过DEAE 纤维素离子交换层析法蛋白质被分离出来122【注意事项】 装柱时要避免气泡产生。加样时不要搅动床面。 123【思考题】 DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质的基本原理。分析梯度洗脱的机制 124实验十一、质粒的提取与鉴定（设计性实验）125 目的要求1.学生自己设计出提取质粒的方案，写出较完整的设计报告。2.质粒