第七章遗传重组ppt课件

1、第七章 基因重组第一节 基因重组概述一、遗传重组的概念重组：已存在的遗传物质产生新组合的过程；分子间或染色体间重组：经过混合离散染色体产生新的组合。如孟德尔遗传学中非同源染色体的自在组合等景象；分子内或染色体内重组：指由于不同DNA链的剪切和衔接而产生DNA片段的交换和重新组合构成新的DNA分子的过程。二、分子内重组类型同源重组：发生在同源序列间。调理蛋白(如大肠杆菌RecA蛋白)不是序列专注性的，而是同源依赖的。真核生物有丝分裂、减数分裂过程中广泛存在；位点特异性重组：供体和受体分子重组部分通常有一短的同源序列。位点特异性重组酶识别该特异位点，调理这一过程需求多种蛋白的协调作用；转座重组：不

2、需求同源序列。调理这一过程的蛋白(转座酶、整合酶)识别重组分子中短特异性序列；异常重组(illegitimate recombination)：发生于非同源序列之间，是细胞异常作用的结果。包括复制中不正常末端衔接，链滑动或成环。人工重组：体外运用纯化的酶和底物进展的DNA衔接。大肠杆菌四种遗传重组的普通特征类型同源序列RecA蛋白序列特异性酶同源重组需要需要不需要位点特异性重组需特定短序列不需要需要转座重组不需要不需要需要异常重组不需要不需要？第二节 同源重组(homologous recombination)一、同源重组的根本特征同源重组是同源依赖的，不是序列依赖的；重组时两条同源链经过断裂

3、和重接，构成新的双链分子；交换位点可发生在同源区任何位置上；交换位点上，两个双链分子的各一条链进展碱基配对，产 生不同DNA双链之间的衔接区或联会点；依托recA的重组产生一个四条链的Holliday中间体。二、同源重组的两个根本功能遗传混合DNA修复Holliday模型：重组发生在异源双链间，涉及DNA链的打断和重新衔接产生新的分子；Meselson-Radding模型： DNA双链断裂引发重组，在DNA修复中重组发生。三、同源重组模型1、同源重组与减数分裂Recombination occurs during the first meiotic prophase. The stages o

4、f prophase are defined by the appearance of the chromosomes, each of which consists of two replicas (sister chromatids). The molecular interactions of any individual crossing-over event involve two of the four duplex DNAs. 细线期合线期粗线期双线期终变期2、Holliday重组模型1两个具同源序列的DNA双螺旋分子陈列在一同(1)；2切断：核酸酶和RecBC蛋白复合体作用下在

5、一对姐妹染色单体产生切口，切口发生在约相隔4kb就有一个的chiGCTGCTGG序列(2)；3侵入：含有5端切口的单链DNA被RecA蛋白包裹构成RecA-ssDNA细丝，这些相互细丝交换并寻觅相对的DNA双螺旋上的相应序列(3)；4Holliday中间体：切口封锁构成Holliday中间体(4,5)；5分支迁移：两条DNA分子间的交叉点可以沿DNA挪动；挪动实践上是两条DNA分子间交叉的同源单链相互置换的结果(6);6Holliday中间体旋转变构(8 & 9)；7Holliday中间体拆分二次切断，可以有两种情况：Holliday中间体二次切割发生在原断裂的两条单链上，称为非交换型重组，双

6、链中存在异源区域(图10, 11, 12)；Holliday中间体二次切割发生在另外两条单链上，称为交换型重组(图10, 11, 12)。Holliday模型1. 联会：同源双链配对；2. 切刻：联会两分子中各发生一个单链断裂；3. 链交换：断裂单链进展重新碱基配对交换，构成Holliday构型；4. 分支挪动：使Holliday构型交叉点移位；5. 产生二次切刻 ；6. 切刻封锁产生重组分子。3、 Meselson-Radding双链断裂模型 4、环状DNA同源重组过程1双链环状DNA同源重组构成每条DNA分子首尾相连的8字型中间体；28字型中间体的拆分有两种方式：一是产生两个亲体环状DNA

7、分子，但每个各含有一段异源双链区；产生一个由两个亲体DNA分子首尾共价衔接而成的二聚环。5、同源重组模型的实验验证Holliday中间体的电镜察看：电镜下可察看到X1 74 、大肠杆菌质粒等的“8字形构造；用单一切点酶处置“8字形分子，那么构成具有两对一样长度臂的型分子(b, c)，阐明两 个 分子经过同源区共价衔接的。四、细菌的重组1、转化中的重组感受态细胞外表有一种DNA结合蛋白因子，特异性结合双链DNA；在内切核酸酶作用下，一条链被降解，另一条链被吸收到细胞质内；被吸收的单链DNA与蛋白质结合生成遮盖复合物，维护单链DNA免受核酸酶的降解； “遮盖复合物把单链DNA带至受体染色体，经过彼

8、此的重组，单链DNA片段整合到染色体上，置换了宿主染色体的同源部分生成带有错配碱基对的杂合区； 整合过程中产生的错配经过修复机制进展修复。转化机制转化过程中recA蛋白质起着重要作用2、细菌接合中的重组1接合：细胞直接接触，供体DNA经过专门的接合管转移至受体细胞，过程由致育因子F质粒来完成；2接合重组过程F+细胞性纤毛与F细胞外表特异识别位点作用，构成接合管或接合桥；当接合发生在F+及F之间时，F质粒编码的特异内切酶在oriT位点上翻开缺口，F + DNA的一条单链留下复制恢复其双链形状，另一条进入受体细胞的单链以不延续方式合成互补链。染色体上一些特殊区域与F因子的某些部位有同源性，可以让F

9、因子插入，生成Hfr细胞；当Hfr与F结合时，Hfr染色体的转移是以单链方式进展，并以单链方式经过普通重组与寄主染色体整合；F质粒整合需求寄主重组系统RecA蛋白和RecBC蛋白。F因子插入模型染色体上一些特殊区域与F因子的某些部位有同源性，可以让F因子插入，生成Hfr细胞。3、细菌转导中的重组1转导：供体细胞基因经过噬菌体运载进入受体；普遍性转导：被转导DNA片段是随机的；专注性转导：转移的染色体DNA是特定片段。2转导重组的普通特征转导遗传重组都在双链DNA片段和完好DNA分子间发生；转导的重组过程与两个完好DNA分子的重组相类似，起始于单链侵入和取代；转导也需求RecA和RecBC蛋白质

10、。五、同源重组过程的酶学1、RecA蛋白又称做重组酶，分子量约38kD，由recA基因编码，为含4个亚基的四聚体；2、RecA是同源重组最重要的蛋白，主要功能是促进DNA分子同源联会和DNA分子间的单链交换。 一RecA蛋白质3、与重组有关的活性单链DNA结合活性：构成的复合物是DNA单链交换中的活性方式；双链DNA结合活性：依赖于ATP，RecA与双链DNA结合导致解链，并最终促使RecA与单链DNA的结合；NTP酶活性：单链或双链DNA存在时，该蛋白可水解NTP并与DNA结合；但只需ATP水解才干促进联会；促进互补单链复性的才干。4、RecA蛋白的作用方式RecA蛋白首先与单链DNA结合约

11、每分子可结合个核苷酸，构成一条DNA蛋白质细丝需耗费ATP，RecA蛋白即被活化；活化的RecA将双螺旋解旋和分别，同时试图将其结合的单链与被解旋区域退火，如此继续，直到找到互补顺序。一旦有一小部份被真正“退火，ATP供应的能量就会继续驱使配对反响趋于完成，其方向是单链部分。新的杂交双链构成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。 RecA蛋白促进的各类DNA分子间的联会参与联会的DNA分子可以是多种不同的形状分子的组合；但无论那种组合，其中一个分子是单链分子，或者有足够长度的单链区。二RecBCD蛋白质1、RecBCD酶由recB、recC、recD基因编码。2、RecBCD酶的活性作用于单、

12、双链DNA的外切酶活性，因此又称做核酸外切酶V，依赖于ATP；线形DNA的解旋酶活性；序列特异性的单链内切酶活性。RecBCD酶在含有游离双螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用。它结合在双螺旋游离端，利用ATP的能量沿双螺旋前进，经过处DNA解旋又复旋。RecBCD酶在Chi位点上促进重组作用。Chi核苷酸顺序是5GCTGGTGG3，是重组频率较高的部位。当解旋的DNA链上有Chi位点时，RecBCD酶出现特异的核酸酶活性，将接近Chi处约离Chi 4-6碱基处的单链切断。 3、RecBCD的功能三RecE和RecF蛋白质recA突变株的重组频率为10-6 ，recA 、recBC-突变株的重组

13、频率为10-2，残存的重组活力依赖于RecF途径；recE基因编码外切核酸酶VIII，能提高RecF途径的重组效率；该酶对单链DNA只需少量活性，对双链DNA活力较高，无内切核酸酶活力，是一种不依赖于ATP的核酸酶。大肠杆菌同源重组有两条途径：主要是RecBCD途径，次要途径为RecF。第三节 位点特异性重组(site-specific recombination)一、位点特异性重组的普通特点发生在两对DNA分子特定位点间，是涉及一段互补碱基的配对和交换的重组过程；不依赖于DNA顺序同源性虽然亦可有很短的同源序列，而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。整协作用有两个特点：交换是可逆的，原

14、先存在的DNA顺序全部被保管，无丧失；交换的DNA间有一段很短的同源序列，重组交换须经过其中的一个特定的核苷酸。二、噬菌体的整合1、位点特征附着位点att：细菌和噬菌体间发生重组和切除的特异性位点，细菌染色体上的为attB，噬菌体上为attP；attB由顺序O及旁侧顺序B及B组成BOB位点，attP由POP组成POP位点；O序列core顺序为attB和attP共有，是重组发生的位点，由15个核苷酸对组成： 5GCTTT TTTATACTAA3 3CGAAAAAATATGATT52、位点特异性重组中的酶整合酶Int：由噬菌体int基因编码的 DNA结合蛋白，能识别attP及attB位点；担任使BOB与POP位点“联会；整合酶同时是拓扑异构酶I，担任4条DNA链的断裂、互换和重接。整合寄主因子IHF：包括两个不同的亚基，由寄主基因himA和himD编码，IHF与Int相互作用；切除酶Xis：与Int结合构成复合体，能与BOP和POB结合并催化二者间的重组，由噬菌体xis基因编码；蛋白质逆转刺激因子FIS：参与原噬菌体的切除反响，由寄主基因编码。3、噬菌体DNA的重组整合与切除1整合过程Int与IHF与att位点结合；attP及attB配对； att位点共同顺序内准