中国药典微生物限度检查和相关的发展趋势

1、中国药典微生物限度检查和相关的发展趋势2无菌/微生物限度检查理念环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断3微生物限度检查现状与发展趋势1、方法和标准的修订与完善2、技术现状与标准化3、微生物限度检查的几个问题4、微生物限度检查法应用指导原则5、抑菌效力检查法指导原则6、药品微生物检验替代方法验证指导原则7、药品微生物实验室规范指导原则4 1、方法和标准的修订与完善表8 中国药典2005版微生物限度检查法与英美药典比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定计数测定方法平皿法、

2、薄膜过滤法、MPN平皿法、MPN平皿法、薄膜过滤法、MPN控制大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金葡球菌、大肠菌群、肠道菌、肠杆菌科大肠埃希菌、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌；肠杆菌科及某些革兰阴性菌稀释液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培养基/乳糖肉汤培养基pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；乳糖肉汤/其他培养基培养条件与时间细菌数：营养琼脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂，72hrs,57天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，4872

3、hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，57天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂、大豆酪蛋白消化物琼脂，5天控制菌检查结果判断与复试规定一次检出为准不符合标准规定，取大于25g的样品复试一次检出为准计数结果判断与复试规定第一次结果超过规定标准，复试两次，三次结果平均报告不符合标准规定，取大于25g的样品复试测定结果在规定的限度标准5倍以内均为合格5样品10g或10ml+缓冲液至100ml总需氧菌TSA,35 ,48-72h真菌SDA(PDA),20-25 ,5-7d结果(cfu/ml or g) 取1ml样品液图14 USP、BP总需气菌/霉

4、菌及酵母菌计数流程总需气菌、霉菌及酵母菌计数中国药典: 玫瑰红钠琼脂, 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂6对供试品的前处理和一些检验方法进行了完善；具有明显的中国特色，与国际差距显著。计数测定体系的差异： 难以操作，检验繁琐 需气菌总数=细菌数+霉菌及酵母菌？ 1000 1000 100参见：美英欧药典微生物限度标准的浅析，苏德模、胡昌勤、马越，中国药品标准，2005年第3期1、方法和标准的修订与完善7Harmonization(USP/EP/JP):Microbiological Examination of Nonsterile Products The USP and the EP Microbi

5、al Limits Tests are in the final stages of harmonization.They were signed off to Stage6A at the November,2005 meeting of the PDG held in Chicago,IL USA (USP 2006a). Stage6A:REGIONAL ADOPTION USP31 General Information/ Phmarmacopeial Harmonization: The following policy statement was approved by the P

6、DG at its September 2002 meeting. Table2. Status of Harmonization-General Chapters Tests for specified microorganisms EP Stage4 Microbial Enumeration EP Stage4 Microbial Attributes EP Stage4 Stage4:Official Inquiry8Harmonization(USP/EP/JP):Microbiological Examination of Nonsterile ProductsUSP31 Guid

7、e to General Chapters/Chart10 As of May1,2009 chapterMicrobial Limits Tests will be replaced by Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests,and the new chapter Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms will become offic

8、ial. Also on May1,2009,Chapter Microbial Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Products will be replaced by Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for Pharmaceutical Use. This general chaper presents 2 sets of tests. T

9、he 1st set gives the reference methods for determining compliance with monographs. Reference to this chapter in a monographs therefore implies compliance with the 1st set of tests, unless use of the 2nd set of tests has been authorised. The tests in the 2nd set also constitute official methods of th

10、e EP and may be refered to as such, notably in applications for marketing authorisation. It is intended to replace the 1st set by the 2nd set once the monographs concerned have been revised. The 2nd set presents tests developed in co-operation with the JP and USP to achieve harmonised requirements.

11、9Harmonization(USP/EP/JP):Microbiological Examination of Nonsterile Products USPEPMicrobiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests2.6.12 Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests Microbiological Examination of Nonsterile Products:

12、Tests for Specified Microorganisms 2.6.13 Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for Pharmaceutical Use5.1.4 Microbiological Quality

13、of Nonsterile Pharmaceutical ProductsHarmonization Timing/IssuesEP:2007/01 USP:2009/05 JP:2007/10 101、方法和标准的修订与完善2010年版中国药典微生物限度检查法 附录XIII C（一部） 附录XI J （二部）引入培养基适用性实验增加白色念珠菌检查法贴膏剂检查方法的改进限度标准表示方法改变112010年版微生物限度检查法修订1、附录107页，微生物限度检查法供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物（的生长和存活无影响）无毒性。除另有规定外，本检查法中细菌及控

14、制菌培养温度为3035；霉菌、酵母菌培养温度为2328（；控制菌培养温度为3537）。检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。122010年版微生物限度检查法修订2、附录107页，检验量除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；（中药）膜剂为（50）100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验 ）。132010年版微生物限度检查法修订3、附录107页，膜剂供试品取供试品（50）100cm2，剪碎，加（50ml或）100ml的无菌

15、氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为110（或120）的供试液。142010年版微生物限度检查法修订4、附录108页，新增：贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试液。152010年版微生物限度检查法修订5、附录108页，修订：离心沉淀法 取一定量供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。162010年版微生物限度检查法

16、修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26 003枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501白色念珠菌（Candida albicans）CM

17、CC（F）98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003172010年版微生物限度检查法修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57天，加入35ml 含（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后

18、，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。182010年版微生物限度检查法修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48hr，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100c

19、fu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72hr，计数；取白色念珠菌50100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72hr，计数。同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。结果判定 被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。192010年版微生物限度检查法修订7、附录109页，增加：表1常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢纳酚类、

20、乙醇、吸附物稀释剂醛类稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯汞类制剂亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐双胍类化合物卵磷脂碘酒、洗必泰类聚山梨醇酯卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDTA）镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸-内酰胺类抗生素-内酰胺酶202010年版微生物限度检查法修订8、附录109页，增加：若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数

21、报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时，若采用上述计数方法总存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检测。212010年版微生物限度检查法修订9、附录109页，修订：供试品检查（法）（取按验证的方法制备的均匀供试液，）按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成110、1102、1103等稀释级。1.平皿法（采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续23个稀释级

22、的供试液。）222010年版微生物限度检查法修订10、附录109页，修订：培养和计数除另有规定外，细菌培养（48小时）3天，逐日点计菌落数，一般以（48小时）3天的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养（72小时）5天，逐日点计菌落数，一般以（72小时）5天的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至（5）7天进行菌落计数并报告。232010年版微生物限度检查法修订11、附录109页，修订：菌数报告规则 细菌、酵母菌宜选取（细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间）小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数（在30100之间）小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以

23、稀释倍数的值报告1g、1mL或10cm2供试品中所含的菌数。242010年版微生物限度检查法修订12、附录109页，修订：薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于，直径（约）一般为50mm，若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。总冲洗量不得超过1000ml(每片滤膜的总过滤量不宜过大)，以避免滤膜上的微生物受损伤。252010年版微生物限度检查法修订13、附录110页，增加：控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。菌种 对试验菌种的要求同计数培

24、养基的适用性检查。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 094铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 00126控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能

25、力金黄色葡萄球菌MUG培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基促生长能力乙型付伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌27控制菌检查培养基特性试验菌株铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基促生长能力铜绿假单胞菌

26、抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌吐温80玉米琼脂培养物促生长能力+指示能力白色念珠菌282010年版微生物限度检查法修

27、订13、附录111页，增加：控制菌检查用培养基适用性检查增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌（见表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查：取试验菌各（50100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板中，每种培养基平行制备2个平皿，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，计数。被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比生长的菌落形态应一致。培养基抑制能力检查：划线接种试验菌（见表2）于被检培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间

28、下培养，试验菌应不得生长。培养基指示能力检查：分别接种少量试验菌（见表2）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。292010年版微生物限度检查法修订14、附录111页，修订：控制菌检查方法的验证删除阴性菌对照组15、附录113页，修订：梭菌上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的（0.1%新鲜庖肉）梭菌增菌培养基中，（各培养基管在）置厌氧条件下培养（7296）48小时。（如试验管不出现浑浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应）取上述每一培养物，分别涂抹

29、接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在置厌氧条件下培养4872小时。302010年版微生物限度检查法修订16、附录111页，增加：白色念珠菌 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养2448 小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠

30、菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。312010年版微生物限度检查法修订16、附录111页，增加：白色念珠菌若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养2448小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。芽管试验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置3537、13h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。若上述疑似菌

31、为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。322、技术现状与标准化1）培养基 培养基质量标准。 MUG凝集、效价测定用培养基琼脂含量过高。 固体培养基的灵敏度。 2010年版培养基适用性实验 玫瑰红钠琼脂培养基的专属性33实验菌株实验用菌液制备需氧菌计数霉菌及酵母菌计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003大豆酪胨琼脂或大豆酪胨肉汤，3035培养1824小时大豆酪胨琼脂和大豆酪胨肉汤，100cfu3035，3天铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104大豆酪胨琼脂或大豆酪

32、胨肉汤，3035培养1824小时大豆酪胨琼脂和大豆酪胨肉汤，100cfu3035，3天枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC（B）63501大豆酪胨琼脂或大豆酪胨肉汤，3035培养1824小时大豆酪胨琼脂和大豆酪胨肉汤，100cfu3035，3天白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤，2025培养23天大豆酪胨琼脂，100cfu3035，5天沙氏葡萄糖琼脂100cfu，2025，5天黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 003沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，2025培养57天，或直到获

33、得良好的孢子大豆酪胨琼脂，100cfu3035，5天沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天培养基适用性实验（协调案）34检查目标菌推荐培养基特性测试菌株*耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌肉汤促生长能力E.coli、P.aeruginosa抑制能力S.aureus紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力E.coli、P.aeruginosa大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力E.coli抑制能力S.aureus麦康凯琼脂促生长能力+指示能力E.coli沙门菌RVS肉汤促生长能力S paratyphi B抑制能力S.aureus木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力+指示能力S paratyphi B指示能力E.

34、coli铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力P.aeruginosa抑制能力E.coli金黄色葡萄球菌甘露醇盐琼脂促生长能力+指示能力S.aureus抑制能力E.coli梭菌梭菌增菌培养基促生长能力Cl. sporogenes哥伦比亚琼脂促生长能力Cl. sporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力C.albicans沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力C.albicans35玫瑰红钠琼脂培养基的专属性以中检所玫瑰红钠琼脂培养基（批号：050428 ）与营养琼脂培养基（批号：050523 ）比较，加入50100cfu阳性菌在相同条件培养观察，见下表9：大肠铜绿金葡枯草营养琼脂培

35、养基35培养48hrs75819179玫瑰红钠琼脂培养基35培养48hrs574700玫瑰红钠琼脂培养基25培养72hrs454100表10、玫瑰红钠琼脂培养基专属性实验结果362、技术现状与标准化2）、自动化程度低，仍然依赖大量的人工以方法验证为基础，引入更为便捷的供试品前处理技术，规范供试品前处理有条件的地方可以考虑引入自动稀释、自动接种、仪器判读结果等设备和技术3）、75mm薄膜过滤器的研制征对我国中成药品种多、情况复杂，开发研制的75mm薄膜过滤器在目前的验证工作中发挥了重要作用（图1617）。373、微生物限度检查的几个问题原料药的微生物标准问题；药材原粉的界定问题；含豆豉、神曲等发

36、酵成分的中成药制剂标准问题；纯化水微生物限度检查问题；38原料药的微生物标准问题原料药是药品生产过程中引入微生物污染的重要来源之一，虽然一些药品在生产过程或终产品阶段可以采取一些灭菌措施杀灭污染微生物，但可能因为由此引入的死菌体、毒素等无法消除而危害患者，而原料药过高的微生物荷载可能直接挑战一些灭菌措施的有效性，造成灭菌失败，使药品存在更大的安全隐患。所以世界各国药典均规定应对原料药进行微生物检查，以消除或控制其对药品引入的微生物污染。39原料药的微生物标准问题在严格执行药品GMP的前提下，国外药典更为重视原料药的微生物检查，尤其是对一些非灭菌制剂，甚至仅仅对原料药有微生物限度控制要求，而对制

37、剂没有强制要求。中国药典2005版参考了国外药典的这一发展趋势，对于化学药品的片剂、胶囊剂、颗粒剂等6个主要口服制剂在各论和制剂通则中均未做微生物限度检查的强制要求，仅在附录中做出通用性要求，但很多企业不清楚这一变化的背景和两个必要前提，即严格的原料药微生物控制和严格的GMP管理，从而放松了对这些产品的微生物控制，可能会存在潜在风险。40原料药的微生物标准问题中国药典规定，对药品原辅料药的微生物检查参照相应用途的药品进行，即用于非灭菌制剂生产的原料药应按相应制剂的微生物限度标准进行微生物限度控制；而用于灭菌制剂的原料药一般应符合无菌要求。考虑到生产过程中污染微生物可能发生的变化，国外企业通常在

38、生产上自觉执行比制剂要求更为严格的原料药微生物。41原料药的微生物标准问题（1）重视不够 目前一些企业对原料药微生物控制的重要性和意义认识不够，对源头上的问题解决不好，加之GMP执行流于形式，造成了频繁的药品微生物污染事故发生。（2）标准依据不清楚 目前中国药典绝大多数药品原辅料各论项下没有明确的微生物检查标准，而是需要根据实际用途去确定相应的控制标准。42原料药的微生物标准问题（3）抽样不正确 原料药微生物检查的抽样除了应参照相应的抽样原则，还应强调的一点是抽样的环境要求和无菌操作要求，不当的抽样方法不仅可以使得样本对总体没有代表意义、抽取的样本被污染，甚至可因抽样而污染原料。（4）方法不合

39、理 对于原料药微生物检查方法验证应与药品制剂微生物检查方法验证同等重视，否则同样存在检验方法不合理、不科学，检验结果没有意义的问题。43药材原粉的界定问题生药原粉；动物脏器及脏器提取物。含豆豉、神曲等发酵成分的中成药制剂标准问题参见：浅析含豆豉、神曲等发酵成分制剂的微生物限度的沿革与现状，马仕洪、胡昌勤，中国药事，2007，21（09）：70470644纯化水问题USP31/Water for Pharmaceutical PurposeDrinking Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.

40、0mL minimun Maximun action levels are 500 cfu per mLPurified Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun Maximun action levels are 100 cfu per mL Water for Injection: Membrane Filtraion Method Sample Volume-100mL minimun Maximun action levels are 10 cfu per 100m

41、L 45纯化水问题2005版二部P3032010版二部P412 纯化水（Purified Water） 【检查】微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录XI J），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。 这一标准源于国外，在其需气菌培养基统一规定的情况下简单易行。但我国引入后，造成企业大量的意见。在药典现有条件下实际采用2ml实验，1ml测定细菌数、1ml测定霉菌和酵母菌数，再加合起来作为一个检验结果。 主要问题还是培养基和检验体系的差异。464、微生物限度检查法应用指导原则2010年版中国药典一部附录XVIII F2010年版中国药典二部附录XIX P目的：为更好应用

42、微生物限度检查法。对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步说明。（结合2010年版中国药典微生物限度检查法详细解读）。475、抑菌效力检查法指导原则2010年版中国药典一部附录XVIII D2010年版中国药典二部附录XIX N抑菌效力检查法指导原则目的 如果药物本身不含有充分的抗菌力，在正常储存和使用过程中可能发生细菌污染和大量繁殖；对患者引起污染或造成药物变质。在生产过程中添加适合的防腐剂以保证药品的质量。 所有防腐剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品的质量和用药安全，添加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。 防腐

43、剂效力的测定可为生产过程中添加防腐剂提供指导，随着科学发展，新型防腐剂大量出现，防腐剂效力的测定更为重要；使生产者正确掌握产品中添加防腐剂的效力，有助于选择合适的防腐剂，也可对防腐剂使用的正确性给予评价。抑菌效力检查法指导原则国内外现状 目前欧洲、美国、英国等国药典均已在附录中收载了防腐剂效力测定，虽然方法不同，但均采用了生物测定方法。我国药典防腐剂效力测定目前还是空白，有必要经过研究，制订出科学、简便、易行的测试方法收载于药典附录中。防腐剂效力的测定，不但为生产者提供正确的使用防腐剂的指导，而且可对使用防腐剂的正确性给予评价。50抑菌效力检查法指导原则基本规定抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、

44、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂的确定。如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。51抑菌效力检查法指导原则基本规定所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂

45、有效浓度应低于对人体有害的浓度。在制剂通则中要求具有抗菌活性的制剂，不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。52抑菌效力检查法指导原则实验要点设计实验方案；验证计数测定方法；制备浓菌液（108cfu/ml）；原包装接种；立即计数与第7、14、28天计数；计数结果的常用对数值比较；结果判断。536、药品微生物检验替代方法验证指导原则2010年版中国药典一部

46、附录XVIII E2010年版中国药典二部附录XIX O54药品微生物检验替代方法验证指导原则本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定方法用于药品微生物的检验提供指导。微生物检验的新技术基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等； 直接测定的被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞计数法、流式细胞计数法等； 基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。 55药品微生物检验替代方法验证指导原则在生物技术和制药行业中，对微生物质量进行控制主要有两方面的工作：过程监控和成品放行。传统方法的弱点是检验速度慢。利用传统方法

47、所得到的微生物质量控制信息，只能作为产品放行评价的一部分内容，而不能用于及时指导生产过程中的各工艺环节。替代方法的优点是检验速度快，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价。在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法56参数定性检验定量检验准确度精密度专属性检测限定量限线性范围重现性耐用性验证参数表注：表示需要开展 表示不需要开展药品微生物检验替代方法验证指导原则57验证参数与国外药典比较，这部分内容有所不同。在定性检验的验证中，借鉴了美国药典的规定，需要开展的验证参数为专属性、检测限、重现性和耐用性，放弃了欧洲药典对准确度和精密度的规定。 在定量检验的的验证中，借鉴了欧

48、洲药典的规定，除检测限外，其他参数均需要验证。 58定性检验的方法验证1、专属性专属性是指检测样品中可能存在的微生物种类的能力强调应关注样品存在对检验结果的影响研究表明，在使用依赖培养技术的替代方法时，样品的存在会导致检验出现假阴性 对于不依赖培养技术的替代方法，样品的存在还可能导致检验出现假阳性 对验证数据可采用2检验 59定性检验的方法验证2、检测限检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量 ，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量 验证的关键是确定接种菌的最低数量，与国外药典规定相同，要求该数量应能够在采用药典方法检验时，有50的检出率对验证数据可采用2检验 60定性检验的方法验证3、重现性重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度 ，反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力 验证的关键是使接种菌的量在检测限以上评价验证结果时，应排除样品均一性的影响对验证数据可采用2检验61定性检验的方法验证4、耐用性耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据 对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键