制药工艺学第十八章 维生素的生产工艺

1、 第四篇 药物(yow)制备工艺学第十八章 维生素发酵(f jio)生产工艺共四十六页定义：维生素是一类生物生长发育起调节作用的、化学结构不同的、小分子有机化合物，人体内不能合成，必须从食物(shw)等中摄取。18.1 概 述 共四十六页维生素有以下特点： （1）维生素是天然食物中的一种成分，是一种活性物质，对机体代谢起调节和整合作用。 （2）维生素需求量很小。 （3）大多数维生素在体内不能合成，要从外界摄取。 （4）绝大多数维生素是通过辅酶或辅基的的形式参与体内酶促反应(fnyng)体系。 （5）人体内维生素缺乏时，会发生一类特殊的疾病，称“维生素缺乏症”。维生素并不是补品，人体每日需要量是

2、一定的，多摄入并不一定好，使用不当，反而会导致疾病。 概 述 共四十六页 维生素分为(fn wi)脂溶性和水溶性两大类。 脂溶性：维生素A，D，E，K，Q和硫辛酸等。 水溶性：维生素B1、B2、B6、B12、烟酸、泛 酸、叶酸、生物素和维生素C等。 概 述 共四十六页维生素的分类(fn li)5名称(mngchng)学名及俗名生物作用维生素A族视黄醇抗干眼病维生素D2麦角钙化醇抗软骨病维生素D3胆钙化醇抗软骨病维生素E族生育酚抗不育维生素F族亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸降胆固醇及防血栓维生素K族叶绿醌，合欢醌，甲基萘醌抗出血维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。共四十六页水溶性维生素 名

3、称(mngchng)学名(xumng)及俗名生物作用维生素B1硫胺素抗神经类维生素B2核黄素抗口角溃疡，唇炎维生素B3族（维生素PP）烟酸，烟酰胺抗糙皮病维生素B5泛酸抗癞皮病维生素B6族吡哆醇，吡哆醛，吡哆胺抗皮炎维生素B9族叶酸，黄嘌呤，赤嘌呤，蝶酸等抗恶性贫血维生素B12钴胺素，氰钴氨素，羟钴胺素等抗恶性贫血维生素B13乳清酸抗早衰维生素BTL肉碱营养强化剂维生素C抗坏血酸抗坏血病维生素H（维生素B8）生物素抗毛发脱落及脂肪代谢混乱共四十六页 维生素与辅酶、辅基的关系 长期以来，人们就认识到食物中缺乏某种维生素，会导致某种疾病，维生素在机体的代谢中起着十分重要的作用，后来陆续发现大部分维

4、生素或者其本身就是辅酶、辅基，或者是辅酶、辅基的组成部分。例如(lr)维生素B1（硫胺素），它在体内的辅酶形式是硫胺素焦磷酸（TPP），是酮酸氧化脱羧酶的辅酶，又如泛酸，其辅酶形式是COA，是转乙酰基酶的辅酶。 概 述 共四十六页 生产(shngchn)方法 （1）化学合成法 烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素B1、B6、D、E、K等。（2）发酵法 B12、B2，维生素C和生物素，维生素原等。（3）生物提取法 从猪心中提取辅酶Q10，从槐花米中提取芦丁，从提取链霉素后的废液中提取B12等。 概 述 共四十六页生产工艺主要维生素的生产有三种方法。1.微生物发酵和微藻类的生物转化法（统称生物合成法）发展非

5、常快。2.化学合成法是目前生产维生素得主要方法。3.天然提取法是从富含维生素的天然食物(shw)或药用植物中浓缩、提取而得。目前只有极少数得维生素采用提取法。如维生素A原、维生素E等。共四十六页脂溶性维生素工业生产状况(zhungkung) 共四十六页水溶性维生素工业生产状况(zhungkung) 共四十六页现状 2001年维生素H投产成功，我国成为世界上极少数能够生产全部维生素品种的国家(guji)。 2002年我国维生素原料产量达8.2万吨，其中维生素C超过5万吨，成为世界上最大的原料药生产国和出口国。维生素制剂年产量260280亿支/片/瓶，以片剂、注射液和胶囊为主。共四十六页中国科学院

6、上海生物技术研究所发明了维生素C的两步发酵法，使国内维生素C的生产技术达到世界先进水平。湖北广济药业公司对维生素B2实验室发酵生产技术的进一步改进，使其实现了维生素B2工业化的规模生产。浙江新和成股份有限公司在国内首先实现了维生素E中间体三甲基氢醌和异植物醇的工业化生产，打破了国外维生素巨头(jtu)的技术垄断。中科院攻克的维生素D3生产新工艺，使国内维生素D3的成本低于国外同类产品10%15%。维生素中生产难度最大的产品维生素H在浙江医药股份有限公司及新和成公司研制成功，填补了维生素产品国产化的一个空白。共四十六页2005年6月，浙江鑫富收购了湖州狮王，一跃成为全球D-泛酸钙的龙头。现在，占

7、据了国际50%的市场和国内90%市场的鑫富药业在有效消化国际市场上部分存量后，自去年下半年开始对产品进行试探性提价，目前已累计(li j)上涨超过80，充分证明了公司在国际上的定价能力。广济药业核黄素（维生素B2）国内外市场占有率也达到了85%和35%。目前年产能超过2500吨，2007年计划将核黄素产能扩大到3000吨。Vc自91起中国就逐渐成为全球的生产基地，仅东北制药一家就占全球20%的市场份额，而目前的上涨主要是由于中国各主要VC生产厂限制产量所至，这也充分说明了中国在国际市场中的定价能力。共四十六页18.2 维生素C的生产工艺18.2.1 概述维生素C又称抗坏血酸(ascorbic

8、acid)，能参与人体内多种代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管的渗透性及血浆的凝固，刺激人体造血功能，增强机体的免疫力。另外，由于它具有较强的还原(hun yun)能力，可作为抗氧化剂，已在医药、食品工业等方面获得广泛应用。现状 维生素C（vitamin C）是目前世界上产销量最大，应用范围最广的维生素产品。目前全世界维生素C的产量约为10万吨/年，全球市场销售额5亿美元。共四十六页 18.2.2维生素的化学结构(jigu)和性质 维生素C(多羟基不饱和内酯衍生物)分子中有两个手性碳原子，故有4种光学异构体，其中L（+）抗坏血酸效果最好，其他三种临床效果很低或无效。共四十六页 18.2.

9、3维生素的化学结构和性质 白色粉末，无臭、味酸、熔点190-192，易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种(y zhn)还原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在碱液中或有微量金属离子存在时，分解更快，但干燥结晶较稳定。 共四十六页18.2.3生产工艺莱氏(li sh)化学合成法 二步发酵法 共四十六页18.2.3.1工艺(gngy)路线发展莱氏法化学合成（1933年莱氏(Reichstein)） 莱氏法是维生素C生产(shngchn)的经典方法，是由Reichstein和Grussner研究开发的。以D-葡萄糖作为起始原料，经催化加氢制成D-山梨醇，再经醋杆菌深层发酵氧化制得收

10、率很高的L-山梨糖，L-山梨糖经丙酮和硫酸处理（生产上俗称丙酸化）生成双丙酮-L-山梨糖（简称双酮糖），再用苯或甲苯提取，提取液经水法除去单酮山梨糖后蒸去溶剂而后分离出来，用高锰酸钠氧化、水解、酯化、转化、中和便得Vc。共四十六页维生素C生产工艺18.2.3.2 莱氏法化学合成工艺(gngy)共四十六页18.2.3.2 莱氏法工艺(gngy)路线转化 酸化 HCl氧化 NaOH, O2, KMnO4 酮化 H2SO4丙酮加氢 H2D-葡萄糖D-山梨醇双丙酮-L-山梨糖维生素CL-山梨糖酶菌氧化 O2双丙酮-L-古龙酸2-酮-L-古龙酸维生素C生产工艺共四十六页18.2.3.2莱氏法工艺过程 山

11、梨醇发酵菌种 醋酸杆菌属可使山梨醇氧化成山梨糖。 发酵条件 温度为26-30，最适pH为4.4-6.8。pH4.0以下菌的活性受影响。 用0.5%酵母浸膏为主要营养源，山梨醇浓度为19.8%，通气量1800ml/min，30培养33h，山梨糖收率可达97.6%。 氮源：无机氮源不能利用，使用有机氮源。 金属离子的影响：Ni2+、Cu2+能阻止菌的发育，铁能妨碍发酵，为了(wi le)使发酵顺利进行，需用阳离子交换树脂将山梨醇中的金属离子去掉。 共四十六页 整个合成过程中必须保持第4位碳原子的构型不变；维生素C的总收率约60%。-国外工艺中主要采用 C-4内酯化、C-2烯醇化： 酸转化：配料比2

12、-酮基-L-古龙酸：38%盐酸：丙酮(bn tn)=1：0.4：0.3 （质量/体积） 碱转化：先形成2-酮基-L-古龙酸甲酯，加NaHCO3 转化生成维生素C钠盐，经氢型离子交换树脂酸化，在50-55下减压烘干，得粗品维生素C。共四十六页18.2.3.3 两步法发酵(f jio)工艺维生素C的化学合成方法(fngf)一般指莱氏法，后来人们改用微生物脱氢代替化学合成中L山梨糖中间产物的生成，使山梨糖的得率提高一倍，我国进一步利用另一种微生物将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，再经化学转化生产维生素C，称为两步法发酵工艺。这种方法(fngf)使得维生素C的产量得到大幅度提高。共四十六页两步发

13、酵法两步发酵法是相对莱氏法而言的，即山梨醇发酵生成山梨糖后，山梨糖又经第二步细菌氧化，直接生成2-酮基-L-古龙酸，而废除了丙酮(bn tn)化和化学氧化两个步骤。反应过程为D-葡萄糖催化加氢制山梨醇，山梨醇经发酵生成L-山梨糖，再经第二步发酵到2-酮基-L-古龙酸。共四十六页 18.2.3.3 两步法工艺(gngy)共四十六页 18.2.3.3两步发酵(f jio)工艺2-酮-L-古龙酸内酯化，烯醇化 生物转化 假单孢菌D-山梨醇维生素C（L-抗坏血酸）L-山梨糖氧化 醋酸杆菌共四十六页 目前维生素C的生产主要采用(ciyng)两步发酵法。即以葡萄糖为原料，经高压催化氢化制备山梨醇，然后以山

14、梨醇为原料经两步微生物（黑醋菌、假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌株）发酵制备2-酮基-L-古龙酸，再将此酸酸（或碱）转化等工序制得粗品维生素C，粗品维生素C经精制得成品Vc。共四十六页 18.2.3.3两步发酵(f jio)的工艺1 D-山梨醇的化学合成 50%葡萄糖溶液在75下加入活性炭，用石灰乳液调节pH8.4，加镍催化剂，通氢气，压力(yl)3.43MPa ，反应温度140。反应结束后，静置沉降出去催化剂，反应液经离子交换树脂、活性炭处理后，减压浓缩，得到含量60-70%的D-山梨醇，无色透明或微黄色透明粘稠液体，收率约97%。共四十六页2 2-酮-L-古龙酸的微生物发酵 第一步发酵

15、：黑醋酸杆菌（从D-山梨醇到L-山梨糖） 第二步发酵：葡萄糖酸杆菌和巨大(jd)芽孢杆菌混合培养发酵罐：气升式反应器，100立方米。（3） 2-酮-L-古龙酸的分离纯化 发酵液中：2-酮-L-古龙酸8%，杂质有菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等。除杂操作：加热、离心。共四十六页 莱氏法是最早生产维生素C的方法,其以葡萄糖为原料,先经黑醋菌发酵生成(shn chn)L-山梨糖,再经丙酮化及NaClO 氧化、水解得到2-酮-L古龙酸钠,然后进行化学合成得到维生素C。 此法存在着很多缺陷,如生产工艺复杂、劳动强度大、生产环境恶劣、易对人体造成伤害,因此人们不断对此工艺进行改进。共四十六页18.2.3.

16、3 二步发酵(f jio)菌种及发酵(f jio)工艺 18.2.3.3.1 第一步发酵A. 菌种一步发酵中所用菌种为黑醋酸杆菌（Gluconobacter melagenus），简称黑醋菌。最常用的生产菌株为R-30，其主要特征是：细胞椭圆至短杆状，G+，无芽孢，大小为（0.50.8）m（1.02.2）m。端生草根鞭毛运动，菌落(jnlu)边缘整齐，微显浅褐色。生长最适温度为3033，氧化D-山梨醇的发酵收率可达98以上。共四十六页B. 培养基共四十六页C. 发酵过程特征 在发酵过程中，控制发酵温度34，初始pH5.15.3。该氧化反应的耗氧量较大，所以通气比要求1:1 VVM以上。即使在通

17、气量较大，且搅拌转速较高的条件(tiojin)下，发酵至4h后溶解氧浓度急剧下降，甚至接近于零。直到10h左右才逐渐回升。当溶解氧浓度回复至最高点，呈水平直线时，表示该反应已达终点。 该发酵过程受山梨醇底物浓度的影响，当其浓度超过250 g/L时，底物对产物形成有抑制作用。故要获得高浓度山梨糖时，必须采用流加发酵方式。为了配合第二步的高浓度山梨糖流加发酵工艺，尽可能提供一步发酵的最终山梨糖浓度是至关重要的。目前山梨糖浓度可达450 g/L共四十六页18.2.3.3.2 第二步发酵(f jio)菌种 第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconoba

18、cter oxydans），大菌可采用巨大芽孢杆菌（Bacillus megateriam），称2980菌， 或蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），称152菌， 或浸麻芽孢杆菌（Bacillus macerans），称169菌。也可采用其他一些杆菌与小菌混合培养。工业生产过程中使用最多的为2980及152混合菌。氧化葡萄糖酸杆菌的主要特征为：细胞椭圆至短杆状，G-，无芽孢。30培养2d后大小为（0.50.7）m （0.61.2）m ，单个或成对排列(pili)。在葡萄糖培养基上生长极微弱，甘露醇培养基上生长良好。共四十六页B. 培养基共四十六页C. 发酵(f jio)过程特征第二步

19、发酵为混合菌种发酵。由于大、小菌两者的最适培养条件是不同的，所以其操作适宜条件是兼顾大、小菌两者的条件。通常操作温度为30；初始pH控制在6.8左右。该反应虽属氧化反应，但对氧的消耗并不很大。气升式发酵罐非常适合该发酵过程。溶氧浓度控制在20即可。山梨糖的初始浓度对产物的生成影响较大。间歇发酵时初始山梨糖浓度超过80 g/L，会对产物生成产生抑制。所以需采用高浓度山梨糖流加发酵方式。若采用建立在数学模型基础(jch)上的流加控制策略，二步收率可达83。共四十六页18.2.3.3.3 2-酮基-L-古龙酸的分离(fnl)原理 山梨醇经两步微生物发酵主要生成2-酮基-L-古龙酸，使发酵液酸度提高，

20、为了保证产酸正常进行，必须定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使pH值保持7.0左右，这样(zhyng)发酵终点所得溶液是含古龙酸钠及少量古龙酸的发酵液。在发酵终点时，用于发酵的芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，使大量的菌体蛋白溶入发酵液中。因此，发酵液中除了含有一定量的2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸外，还含有大量的菌体蛋白。共四十六页 要将2-酮基-L-古龙酸钠从发酵液中分离提取出来，必须先除去菌体蛋白。 除去菌体蛋白，可将发酵液用盐酸酸化调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀，静置数小时后去掉菌体蛋白。除去菌体蛋白的发酵液中含2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸，由于2-酮基-

21、L-古龙酸钠（能解离为阴、阳离子），用732阳离子交换树脂进行交换可去掉其中Na+而得2-酮基-L-古龙酸稀液。高温下2-酮基-L-古龙酸不稳定(wndng)，所以为了浓缩古龙酸溶液使其达到一定浓度，可采用减压浓缩的方法。由于 低温下2-酮基-L-古龙酸溶解度较小，所以可经冷却结晶得2-酮基-L-古龙酸晶体，从而实现了从发酵液中提取分离2-酮基-L-古龙酸的操作过程。 共四十六页 1工艺过程 2-酮基-L-古龙酸的制备(zhbi)工艺过程如下图所示： （1）离子交换 将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以(23)m3/h的流速(l

22、i s)压入一次阳离子交换柱进行离子交换。当回流到pH3.5时，开始收集交换液，控制流出液的pH值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于1mg/ml以下为止。当流出液达到一定pH值时，则更换树脂进行交换，原树脂进行再生处理。18.2.3.3 酮基-L-古龙酸的制备工艺共四十六页 将经过一次交换后的流出液和洗液合并，在加热罐内调pH至蛋白质等电点，然后加热至70左右，加0.3%左右的活性炭，升温至9095后再保温(1015)min，使菌体蛋白凝结。停搅拌，快速冷却，高速离心过滤得清液。 将酸性上清液打入二次交换柱进行离子交换，至流出液的pH1.5时，开始收集交换液，控

23、制流出液pH1.51.7，交换完毕，洗柱至流出液古龙酸含量在1mg/ml以下为止。若pH1.7时，需更换交换柱。 （2）减压浓缩结晶 先将二次交换液进行一级真空浓缩，温度45，至浓缩液的相对密度达1.2左右，即可出料。接着，又在同样条件下进行二级浓缩，然后加入少量(sholing)乙醇，冷却结晶，甩滤并用冰乙醇洗涤，得2-酮基-L-古龙酸。 如果以后工序使用碱转化，则需将2-酮基-L-古龙酸进行真空干燥，以除去部分水分。共四十六页 （1）pH值 发酵液在上柱之前pH值非常重要，因为调好等电点是凝聚菌体蛋白的重要因素。pH偏高偏低都会使上柱发酵液中的蛋白含量(hnling)升高，进而污染交换树脂

24、，使离子交换效率下降。 （2）交换液流速 交换液流速过小，树脂处理能力下降，流速过快，交换效率会下降，因此交换液流速的确定要保证有较高的交换率的前提下，提高树脂层的处理能力，生产上一般维持在(23)m3/h。 （3）树脂的再生程度 树脂再生的好坏直接影响2-酮基-L-古龙酸的提取，标准为进出酸差小于1%、无Cl。 （4）浓缩温度 浓缩温度取决于真空度，真空度高浓缩温度低，但动力消耗大，汽化量大容易跑料；真空度低时，浓缩温度高，料液易炭化。生产上一般控制在45左右较好。2工艺控制(kngzh)及影响因素共四十六页18.2.3 两步发酵法 优势(yush)1. 以生物氧化代替化学氧化，省掉了酮化反应；2. 节约了大量易燃、易爆、有毒的化工原料，大大减少了“三废”处理(chl)，