实验性肝癌中比较槐耳与IL-2对PTEN和IL-2R阳性细胞的影

1、实验性肝癌中比较槐耳与IL-2对PTEN和IL-2R阳性细胞的影响 研究生 陆鹏 指导教师 陈莉教授1前言 肝癌是我国第三位恶性肿瘤，约占全世界肝癌病例的42.5%。该病病程短、进展快、病死率高，严重危害着我国人民的健康和生命。 槐耳清膏是一种入药1500年但湮没已300余年的重要药用菌，作为一种治疗肝癌的药用菌，在民间早已有应用。槐耳清膏标本经鉴定学名为Trametes Robiniophila Murr.，中文名为槐栓菌。2 PTEN (与细胞骨架蛋白tensin同源在肿瘤的10号染色体有缺失的磷酸酯酶)是定位于10q23的一种具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，PTEN蛋白能够抑制肿瘤的浸润和转

2、移，诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。 IL-2被称为T细胞生长因子。IL-2主要以自分泌或旁分泌的方式，诱导特异性CTL克隆增殖，杀伤肿瘤细胞。3 本课题拟通过诱癌剂诱导大鼠肝癌，并通过应用槐耳清膏和IL-2干预癌形成过程，诱癌20周后观察肝组织的病理变化、IL-2R阳性细胞的表达情况以及PTEN表达水平，从而探讨与比较槐耳与IL-2对于肝癌形成与发展的影响，及其可能的作用机制。4材料与方法1 研究对象 2 主要试剂3 方法40只雄性SD大鼠（本校实验动物中心）5动物实验试剂 二乙基亚硝胺（DENA，Sigma公司）、金克-槐耳清膏（江苏启东盖天力药业有限公司）、注射用重组人IL-2（江苏金丝利药

3、业有限公司）。6 免疫组化试剂 IL-2R/ CD25链单克隆抗体（NeoMarkers公司）、 即用型免疫组化二步法染色试剂盒 （福州迈新 KIT-9801）。7 RT-PCR试剂 RT试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司） PCR试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司） 100bp DNA ladder（华美生物工程公司） PTEN引物（上海生工生物技术服务有限公司） 内参GAPDH引物（上海生工生物技术服务有限 公司） 81) 动物实验2) 常规切片制作3) HE染色及镜下观察 4) 免疫组织化学染色检测IL-2R阳性细胞 5) RT-PCR检测PTEN表达 6) 统计分析940只正常雄性

4、SD大鼠，体重100120g。大鼠置普通级动物实验室饲养，标准饲料喂养及自由饮水，气温2025，湿度为50-60%，2-3只/笼10实验分组 正常对照组 (G1) 单纯诱癌组 (G2) 诱癌加槐耳清膏组 (G3) 诱癌九周后槐耳清膏组 (G4) 诱癌九周后IL-2组 (G5)生理盐水DENADENA+九周后槐耳清膏DENA+九周后IL-2DENA+槐耳清膏11DENA灌胃，70mg/kg，每周一次，连续用药15周后停药12免疫组化二步法抗原修复：柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）煮沸20minIL-2R 链单克隆抗体（工作浓度：1400）37孵育30min，4过夜捷达形态分析系统计数IL-2R阳性细

5、胞数13PCR执行程序：94，2min94，40秒（变性） 32次 56，40s72，40s72，5min4 （复性） （延伸） （总延伸）第10个循环结束后（停留在72，提前10秒）暂停，PCR反应体系中加入内参GAPDH引物2.0l后同管扩增。14PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳 四星凝胶图像分析系统测定条带密度PTEN的相对表达量=( LP- LB )/(LG -LB) LP PTEN条带密度LG GAPDH条带密度LB背景密度15Stata 6.0统计软件多组等级资料 秩和检验（Kruskal-Wallis法）率的比较 卡方检验两样本均数的比较 t检验多个样本均数的比较 单因素方差分析两变

6、量依存关系 直线相关分析检验水准0.0516结果 1 病理观察2 免疫组化结果观察3 RT-PCR检测PTEN表达4 比较IL-2R阳性细胞数与PTEN相对表达量的关系171) 各组大鼠肝脏病理观察2) 各组鼠肝组织正常、不典型增生与癌形成 的比较3) 各组癌形成率的比较18正常对照组，HE染色250 19单纯诱癌组，癌形成伴有明显坏死 HE染色250 20诱癌加槐耳清膏组，不典型增生结节 HE染色250 21诱癌加九周后槐耳清膏组 卵圆细胞增生 HE染色250 22诱癌加九周后IL-2组 以透明细胞为主的增生伴癌结节形成 HE染色250 23各组中组织切片正常、不典型增生与癌形成的比较 24

7、百分率（）组别秩和检验：2 =20.053 （p0.0005） 25组间比较各组癌形成率（卡方检验） G 1 2 3 4-|- 2 | 10.370 | 0.001 | 3 | 1.436 5.333 | 0.231 0.021 | 4 | 2.637 3.899 0.258 | 0.104 0.048 0.612 | 5 | 2.637 3.899 0.258 0.000 | 0.104 0.048 0.612 1.000261) IL-2R阳性细胞的特征与分布2) 各组大鼠肝脏中IL-2R阳性细胞数的比较3) 诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数的比较27单纯诱癌组 肝癌

8、中IL-2R阳性表达于淋巴细胞膜及胞浆 免疫组化二步法50028诱癌加槐耳清膏组 肝组织中IL-2R阳性表达于淋巴细胞膜及胞浆 免疫组化二步法50029F17.57，（p0.00）组别IL-2R阳性细胞数各组大鼠肝脏中IL-2R阳性细胞数的比较（单因素方差分析）30 G 1 2 3 4-|- 2| 0.975 | 1.000 | 3| 20.308 19.333 | 0.020 0.048 | 4| 19.761 18.786 -0.548 | 0.018 0.045 1.000 | 5| 38.646 37.671 18.338 18.886 | 0.000 0.000 0.053 0.03

9、3组间比较各组肝脏中IL-2R阳性细胞数31诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数的比较（t检验）32IL-2R阳性细胞数组别331) PTEN阳性表达2) 各组大鼠肝脏PTEN相对表达量的比较3) 诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中PTEN相对表达量的比较 34PTEN阳性表达 正常对照组PCR产物电泳检测结果 500bp578bp (PTEN)452bp (GAPDH)35单纯诱癌组PCR产物电泳检测结果 500bp578bp (PTEN)452bp (GAPDH)500bp578bp (PTEN)452bp (GAPDH)诱癌加槐耳清膏组PCR产物电泳检测结果 36诱癌加

10、九周后槐耳清膏组PCR产物电泳检测结果 诱癌加九周后IL-2组PCR产物电泳检测结果 500bp500bp578bp (PTEN)578bp (PTEN)452bp (GAPDH)452bp (GAPDH)37各组大鼠肝脏PTEN相对表达量的比较（单因素方差分析）F=10.16,（p=0.00）PTEN相对表达量组别38 G 1 2 3 4-|- 2| -1.749 | 0.000 | 3| -0.706 1.044 | 0.221 0.038 | 4| -0.973 0.776 -0.268 | 0.029 0.169 0.933 | 5| -1.121 0.628 -0.416 -0.14

11、8 | 0.008 0.358 0.737 0.991组间比较各组肝脏肝脏PTEN相对表达量39诱癌各组无癌形成病例与癌形成病例中PTEN相对表达量的比较 （t检验）40PTEN相对表达量组别41G2、G4、G5组 PTEN表达缺失病例与PTEN表达病例的IL-2R阳性细胞数的比较（t检验）42IL-2R阳性细胞数组别43诱癌各组IL-2R阳性细胞数与PTEN相对表达量的关系（直线相关分析）PTEN相对表达量IL-2R阳性细胞数相关系数r=0.51, p=0.00644讨论1 槐耳的抑癌作用2 IL-2的抑癌作用 3 槐耳与IL-2抑癌作用的比较 45 唐新修本草中记载：其味苦辛平、无毒，有“

12、治风”、“破血”、“益力”之功效 1977年上海市肿瘤医院的记载，青岛的一名晚期肝癌患者，服用槐耳子实体泡制的水，竟奇迹般的治愈了肝癌46 肝癌形成之初，应用槐耳清膏能有效地抑制肝癌的形成 肝癌形成过程中，应用槐耳清膏对肝癌也有显著的抑制作用 病理观察47 槐耳能够增加肝内IL-2R阳性细胞数免疫组化结果观察无癌与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数比较 槐耳增加肝脏IL-2R阳性细胞的作用不受癌形成的影响48 肿瘤早期使用槐耳清膏可能通过维持抑癌基因PTEN表达水平来发挥抑癌作用。随着癌形成的进展，槐耳对抑癌基因的影响作用减少 大鼠肝脏PTEN相对表达量研究49 槐耳清膏一方面能激活IL-2R阳

13、性细胞，发挥细胞免疫的抑癌作用， 另一方面维持抑癌基因PTEN的表达而达到抑癌的目的 PTEN表达与IL-2R阳性细胞数的关系50IL-2肿瘤特异性CTL肿瘤细胞+渗透性细胞溶解诱导细胞凋亡肿瘤细胞51 IL-2能有效地抑制肝癌的形成病理观察52 IL-2能够有效地激活肝内IL-2R阳性细胞， 其作用要强于槐耳 免疫组化结果观察 当体内有肝癌形成时，IL-2激活体内IL-2R阳性细胞的作用减弱无癌与癌形成病例中IL-2R阳性细胞数比较53 IL-2抑癌的作用机制并不通过影响PTEN来实现大鼠肝脏PTEN相对表达量研究54 槐耳与IL-2均能激活肝脏内的IL-2R阳性细胞，且IL-2激活肝内IL

14、-2R阳性细胞的作用要强于槐耳 当体内癌已形成时，槐耳激活IL-2R阳性细胞的作用不受影响，而IL-2的作用显著下降。槐耳还可以在肿瘤形成早期增强非特异性的免疫反应 槐耳还能抑制PTEN的失活，在基因水平发挥抑癌作用的。而IL-2却没有显示出对PTEN表达有显著的影响 55 IL-2在临床治疗中的疗效并不十分令人满意，因其严重的剂量依赖毒性，使用低剂量的IL-2在临床治疗黑素瘤时效果令人失望。大剂量使用IL-2时可引起毛细血管渗漏综合症等不良反应，以及发热、疲乏等副作用。 槐耳作为一种纯天然药物，其毒副作用未见报道，疗效将优于IL-2。56结论 1、槐耳清膏通过增加肝内IL-2R阳性细胞数，调

15、节机体内环境的免疫功能，增强特异性和非特异性抗肿瘤免疫，能够有效的抑制肝癌形成，还能通过维持肝内抑癌基因PTEN的表达水平发挥抑癌作用，说明槐耳的抑癌作用是通过多种机制、多条途径来实现的。572、IL-2通过增加肝内IL-2R阳性细胞数，增强机体特异性细胞免疫，能够有效的抑制肝癌形成，一旦癌形成后，IL-2激活肝内IL-2R阳性细胞的作用减弱。IL-2并不影响诱癌过程中及癌形成后PTEN的表达。583、虽然IL-2激活肝内IL-2R阳性细胞的能力强于槐耳，但槐耳能调节机体的整体免疫功能，维持抑癌基因PTEN的表达，具有天然、无毒副作用的优点，更适合于临床抗肿瘤治疗，疗效将优于IL-2。59致谢 首先感谢陈莉教授的教导和培养。本课题是在我的导师陈莉教授的精心指导下完成的，从课题的选题、设计、资料的收集、整理和分析