血液检测助力肺癌精准医学

1、标准PCR实验室流式细胞室FISH实验室常规实验室Illumina Mi-Seq测序平台ABI3130测序平台Ion Torront测序平台平台概况MIT “2015年度十大突破技术”Magic Leap Nano-ArchitectureCar Communication Project LoonLiquid Biopsy Megascale DesalinationApple Pay Brain OrganoidsInternet of DNA Supercharged PhotosynthesisThe 10-Year HorizonCancer Stem CellsGenomics T

2、echnologyLiquid BiopsyNanomedicineHealth IT In Cancer Care“液体活检”或将改变癌症治疗的新方法SalivaCTCctDNAUrineChien-Chung Lin et al., Expert Reveiew of Molecular Diagnostics(2015)多平台液体活检技术应用于EGFR突变检测无创，更加安全，更少痛苦;给无法获取组织的病人多一次获得有效治疗的机会;更好的病人关怀(肿瘤复发前耐药发生的持续监控);更快获知病人情况，制定合适的治疗方案; 持续的疗效监测; 检测病情变化 耐药发生或肿瘤复发; 比起传统组织材料，

3、取样更易更快;可以重复取样;相较肿瘤组织异质性的特点，血液标本具有一致性的特点;患者临床医生病理医生以血液为代表液体活检成为当前研究热点欧盟和中国相继批准阿斯利康易瑞沙血液ctDNA伴随诊断非小细胞肺癌患者用药前检测EGFR突变IV IFUM研究：血浆ctDNA检测突变患者其客观有效率（ORR）与组织标本检测突变阳性的患者基本一致，可以指导EGFR-TKI治疗。吴一龙等，中华医学杂志，2015, Vol. 95, No. 46血液ctDNA伴随诊断受到越来越多的认可IVIFUM(易瑞沙后续评估)研究中，652例患者中血液与配对组织EGFR突变状态的一致性是94.3%对于无法获取组织样本或者组织

4、样本量不足以检测的患者，可选择血液ctDNA用于评价EGFR突变状态Jan YD, et al. 2014 ASCO Abstract 1868.EGFR血液检测- IFUM研究：血液检测阳性可以指导TKI用药IVIFUM(易瑞沙后续评估)研究中，血液与配对组织不同EGFR突变状态患者ORR的一致，19外显子缺失患者PFS也一致(10.3月 vs 9.6月)ORR(%)PFS (月)组织血液ctDNA检测EGFR突变阳性可用于指导EGFR-TKI治疗Jan YD, et al. 2014 ASCO Abstract 1868.EGFR血液检测-IFUM研究：血液检测阳性可以指导TKI用药IGN

5、ITE研究探索真实世界NSCLC患者组织/细胞学及血液EGFR基因突变Tissues VS Plasma血液ctDNA突变检测研究-IGNITE StudyConcordanceSensitivitySpecifityn/N (%)95% CIn/N (%)95% CIn/N (%)95% CIAsiaPacn=16871310/1687 (77.7)75.6, 79.6343/692(49.6)45.8, 53.4967/995(97.2)96.0, 98.1Russian=894767/894(85.8)83.3, 88.033/109(30.3)21.8, 39.8734/785(93.

6、5)91.5, 95.1Tissue/cytology SamplesPlasma SamplesADCnon-ADCADCnon-ADCOverall952/2249(42.3%)89/927(9.6%)397/1814(21.9%)60/854(7.0%)AsiaPac862/1749(49.3%)75/525(14.1%)342/1301(26.3%)31/445(6.9%)Russia90/500(18.0%)15/402(3.7%)55/513(10.7%)24/409(7.1%) LBA2_PR: 奥希替尼治疗经治的T790M+晚期NSCLC临床疗效和安全性: AURA I期扩大研

7、究和AURA扩展研究/AURA2研究数据汇总分析James Chih-Hsin Yang,1 Suresh S Ramalingam,2 Pasi A Jnne3, Mireille Cantarini,4 Tetsuya Mitsudomi,5 on behalf of the AURA and AURA2 Investigators and Study Team 1National Taiwan University Hospital and National Taiwan University Cancer Center, Taipei, Taiwan; 2Emory School of

8、 Medicine, Atlanta, GA, USA; 3Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA; 4AstraZeneca, Alderley Park, Macclesfield, UK; 5Kinki University Faculty of Medicine, Osaka-Sayama, Japan James Chih-HsinYang et al,2016 ELCC LBA 2.9研究结论James Chih-HsinYang et al, 2016 ELCC LBA2.AURA II期研究 pool分析证实了AURA I期在

9、T790M阳性的NSCLC患者中使用奥希替尼80mg/天的疗效奥希替尼治疗经治的T790M+晚期NSCLC临床疗效可观，安全可控期待AURA3的进一步验证P1 N=63(95% CI)P2 N=411 (95% CI)ORR71% (57, 82)66% (61, 71)中位PFS9.7 月(8.3, 13.6)11.0 月(9.6, 12.4)中位DOR9.6月(7.7, 15.6) 12.5月(11.1, 未到达)109、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。7月-227月-22Monday, July 18, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。22:35:2222:35:2222

10、:357/18/2022 10:35:22 PM11、人总是珍惜为得到。7月-2222:35:2222:35Jul-2218-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。22:35:2222:35:2222:35Monday, July 18, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。7月-227月-2222:35:2222:35:22July 18, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。18 七月 202210:35:22 下午22:35:227月-2215、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 2210:35 下午7月-2222:35July 18, 202216、业余生活要有意

11、义，不要越轨。2022/7/18 22:35:2222:35:2218 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。10:35:22 下午10:35 下午22:35:227月-22河南省肿瘤医院血液EGFR ctDNA检测68例组织，血液匹配标本的EGFR检测结果(ROC分析) ctDNA+阳性检出率2015年1565635.9%2016年401435.0%总体1967035.7%2015年及2016年1月份ctDNA EGFR检测结果汇总T790M检出率17%The pooled sensitivity, specificity, and DOR were 0.620 95

12、% confidenceintervals (CI), 0.5130.716), 0.959 (95% CI, 0.9290.977), and38.270 (95% CI, 21.09069.444), respectively. The AUSROC was0.91 (95% CI, 0.890.94)A Meta-analysis9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。7月-227月-22Monday, July 18, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。22:35:2222:35:2222:357/18/2022 10:35:22 PM11、人总是珍惜为得到。7月-2222:

13、35:2222:35Jul-2218-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。22:35:2222:35:2222:35Monday, July 18, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。7月-227月-2222:35:2222:35:22July 18, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。18 七月 202210:35:22 下午22:35:227月-2215、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 2210:35 下午7月-2222:35July 18, 202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/18 22:35:2222:35:2218 July 202

14、217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。10:35:22 下午10:35 下午22:35:227月-2219exon21exonEGFR-ctDNA突变情况分析2012.12015.8 期间，分子病理科EGFR突变检测共4582例，阳性2108例，阳性率46%2015年1月8月，EGFR血液ctDNA检测118例，突变39例，阳性率33% EGFR检测数据分析（2012.1-2015.8) 增加采血量； 使用高效专业的提 取试剂盒； 提高试剂灵敏度； 替换新型的高敏感 度的检测技术，如 dPCR, NGS； 优化试剂盒引物和 反应体系； 使用dPCR, NGS等 新技术；ddPCRT79

15、0M位点血液ctDNA突变检测遇到的挑战？a. cfDNA总量少b. 突变丰度低c. 碱基组成复杂跨平台方法学比较ctDNA检测EGFR突变状态 EGFR敏感突变四种检测方法检测EGFR敏感突变具有高灵敏度和高特异性 T790MDigital PCR和AS-PCR检测NSCLC患者血浆T790M突变与组织相比具有高灵敏度，其中Digital PCR更有优势T790M assaySensitivity41%(7/17)29%(5/17)71%(12/17)69%(9/13)Specificity100%(6/6)100%(6/6)83%(5/6)67%(4/6)Concordance57%48%

16、74%68%Thress.K, et al. 2015, Lung Cancer.1992199719992003200620112013Digital PCR初形 提出Digital PCR 第一台芯片dPCR QuantStudio 3D 纳升级芯片出现 BEAMing技术 微滴Digital PCR 1st PCR(1985) 2ed RT-PCR(1996) 3rd Digital PCR(1999) 4 th PCR(?)Digital PCR理论与技术的发展历程Leonardo B et al, 2015, analytical chemisitryDigital PCR的技术流程

17、（以Bio-Rad QX200为例）Impress Study方法学19外显子缺失（n=260）L858R（n=253）T790M（n=246）血浆EGFR突变检出ddPCR48%28%57%QIAGEN therascreen37%20%15%P值P0.0001P0.0001P0.0001 BEAMing：比QIAGEN therascreen更高的T790M检测率Sang-We Kim, et al. 2015 WCLC Oral 16.05.比较血液ctDNA突变检测- Digital PCR vs ARMSAdvantage I-灵敏度高，适合低丰度ctDNAT790M Mt:Wt=1

18、:3000activating mutations, N=32T790M, N=11Fraction of EGFR mutant in total cfDNANumber of EGFR M+ plasma samples631257360.04%0.03%Zhu GS, et al. J Mol Diagn, 2015 17(3); Wang Z J, et al. Plos One, 2014 9(11); Taniguchi et. al., Clin Cancer Res 2011 20Advantage II-一致性高，血浆检出率接近组织Impress Study方法学19外显子缺

19、失（n=260）L858R（n=253）T790M（n=246）血浆EGFR突变ddPCR48%28%57%QIAGENARMS37%20%15%P值P0.0001P0.0001P0.0001Tumor tissuePlasmaTotal +-+13316-099Total131225Sensitivity: 81.5% Specificity: 100%Overall Concordance: 88%Plamsa T790M TestingDigital PCR比ARMS更高的T790M检测率21Advantage III-绝对定量，线性范围广R2=0.42Xu Q, et al. Onco

20、 Targets Ther, 2015: 8 22突变分型对应治疗方案反映实时性早于影像学发现耐药突变反映前瞻性L858RT790MEGFR敏感型突变T790M分子耐药影像学耐药Oxnard GR, et al. Clin Cancer Res. 2014 Mar 15;20(6):1698-705. Digital PCR实时监测T790M的临床应用前景装机、培训河南省肿瘤医院-数字PCR平台建设进展 河南省肿瘤医院-数字PCR预实验结果 患者送检科室住院号性别年龄病理诊断初治突变服药TKI类型持续缓解时间（PFS）影像学PD验证？PD后是否采用化疗或原料药治疗？耐药后敏感突变是否存在？dd

21、PCR耐药后T790M突变宋巍然呼吸内科319190男5059腺癌L858R特罗凯2 months是化疗L858R阴性于荣呼吸内科379177女5059腺癌19 del易瑞沙SD是尚未阴性阴性李书芝呼吸内科342589女7079腺癌L858R凯美纳SD是尚未L858R阴性徐月仙呼吸内科372442女5059腺癌19 del易瑞沙12 months是化疗19 del阴性尚玉兰呼吸内科385253女6069腺癌19 del易瑞沙8 months是尚未19 del阴性胡秀英呼吸内科392335女7079腺癌L858R易瑞沙SD是尚未阴性阴性陈万才呼吸内科292541男4049腺癌19 del易瑞沙1

22、2 months是原料药19 del & T790M阳性梁忠全中西医科381639男4049腺癌19 del易瑞沙8 months是化疗19 del阴性谷书琴呼吸内科322247女6069腺癌未知易瑞沙SD是尚未阴性阴性王培学呼吸内科407364男4049腺癌未知8 months是尚未19 del阴性孙静呼吸内科225614女6069腺癌19 del厄罗替尼SD是化疗阴性阴性刘勇呼吸内科352790男5059未知19 del埃克替尼12 months未知未知19 del & T790M阳性许文莹呼吸内科未知19 del易瑞沙12 months未知未知阴性阴性刘迎春呼吸内科男6069未知L858

23、R特罗凯11 months未知未知L858R & T790M阳性宋学林呼吸内科男6069未知L858R易瑞沙8 months是未知L858R阴性白瑞霞呼吸内科374344女5059腺癌19 del & T790M未知19 del阴性张凤连呼吸内科407292女5059未知未知未知未知未知未知阴性阴性秦进义呼吸内科男5059腺癌未知未知未知未知未知19 del阴性25微滴数字PCR-院内送检及收费说明血液标本采集注意：单项抽取5ml静脉血，置于EDTA抗凝血型管（紫色），不得使用肝素抗凝样本收集后，上下颠倒7-8次，送至分子病理科进行处理2小时内进行血浆分离，如发生溶血则重新采集未能及时分离血浆

24、，可暂存于2-8度冰箱，但不宜超过4小时项目检测收费：T790M单点突变检测：910元T790M联合原发敏感突变检测：1820元EGFR基因全位点突变检测：3510元1st EGFR-TKI耐药PD患者初治无法取材NSCLC患者分子病理科联系电话65587686、6558829426RNArtPCRFragmentationTarget enrichmentAttach barcode adaptorsSequencingSample Preparation “Library” PreparationSecondaryData Analysis Guided as

25、sembly Quality ControlApplication Specific Analysis Read counting Variant calling321Sequence data analysisPrimary Data Analysis Image processing Signal processingClinical ReportExtractionDNAFFPEFFZNWhole BloodMultiplexing“sample DNA labeling”NGS技术原理与流程22例EGFR敏感突变肺腺癌患者血浆标本研究终点ctDNA中EGFR敏感突变、T790M突变NG

26、S检测患者特征患者数（n=22）肿瘤特征患者数（n=22）年龄（岁）64（46-79）肺腺癌22（100%）性别 男 女16（73%） 6（27%）EGFR基因敏感突变19DEL21L858R13（59%） 9（41%）吸烟状态 从不吸烟 既往吸烟12（55%）10（45%）获得性耐药T790M突变阳性阴性11（50%）11（50%）Goldber SB, et al. 2014 ASCO Abstract 8093二代测序(NGS)检测晚期EGFR突变肺腺癌患者循环肿瘤(ctDNA)中EGFR敏感突变和耐药突变突变肿瘤和血浆都检测到肿瘤和血浆都未检测到仅在血浆中检测到仅在肿瘤中检测到共计EG

27、FR T790M765422获得性耐药患者肿瘤组织和血浆中EGFR T790M 耐药突变检测结果NGS检测ctDNA EGFR敏感和耐药突变可行，但仍需更多例证Goldber SB, et al. 2014 ASCO Abstract 8093研究结果 获得性耐药的患者中，11/22（50%）患者的肿瘤组织发生T790M突变，7例患者同时伴有肿瘤和血浆T790M突变； 未存在肿瘤T790M突变的患者中，5例仅在血浆中检测到T790M突变，说明可能存在肿瘤异质性； NGS进行ctDNA T790M检测敏感度为63%，特异性为55%；C1501191BR079EGFRE20ins c.2311_2

28、312insACCCCC:p.N771delinsNPH180/18339.82%EGFR基因18,19,20,21外显子检测范围内未检测到突变不一致IV期 C150125BR073阴性EGFR基因21外显子检测到突变，突变点为L858R，突变为低丰度（10%）不一致无C150126BR081ALK fusion45/31081.45%EGFR基因18,19,20,21外显子检测范围内未检测到突变一致IV期 38例样本的 EGFR 19deletion 检测结果评价试剂金标准方法结果合计阳性（+）阴性（-）阳性（+）11112阴性（-）22426合计132538阳性相符率=a/(a+c)100

29、%84.62%阴性符合率=d/(b+d) 100%96.00%总符合率=（a+d）/(a+b+c+d)100%92.11%kappa值89.27%38例样本的 EGFR T790M 检测结果评价试剂金标准方法结果合计阳性（+）阴性（-）阳性（+）202阴性（-）03636合计23638阳性相符率=a/(a+c)100%100.00%阴性符合率=d/(b+d) 100%100.00%总符合率=（a+d）/(a+b+c+d)100%100.00%kappa值100.00%河南省肿瘤医院83例血浆ctDNA的5种常见肺癌驱动基因NGS检测初步统计结果38例样本的EGFR 19deletion检测结果

30、评价试剂金标准方法结果合计阳性（+）阴性（-）阳性（+）11112阴性（-）22426合计132538阳性相符率=a/(a+c)100%84.62%阴性符合率=d/(b+d) 100%96.00%总符合率=（a+d）/(a+b+c+d)100%92.11%kappa值89.27%38例样本的EGFR L858R 检测结果评价试剂金标准方法结果合计阳性（+）阴性（-）阳性（+）314阴性（-）33134合计63238阳性相符率=a/(a+c)100%50.00%阴性符合率=d/(b+d) 100%96.88%总符合率=（a+d）/(a+b+c+d)100%84.21%kappa值51.28%38

31、例样本的EGFR 20ins检测结果评价试剂金标准方法结果合计阳性（+）阴性（-）阳性（+）011阴性（-）03737合计03838阳性相符率=a/(a+c)100%0.00%阴性符合率=d/(b+d) 100%97.37%总符合率=（a+d）/(a+b+c+d)100%94.74%kappa值0.00%38例样本的EGFR T790M 检测结果评价试剂金标准方法结果合计阳性（+）阴性（-）阳性（+）202阴性（-）03636合计23638阳性相符率=a/(a+c)100%100.00%阴性符合率=d/(b+d) 100%100.00%总符合率=（a+d）/(a+b+c+d)100%100.0

32、0%kappa值100.00% ctDNA易于取得样本，作为组织检测的有效补充；商品化的一线药物(易瑞沙)伴随诊断试剂；后续药效实时监控；检测继发性耐药突变，选择使用3代EGFR TKI药物；总结-I技术平台单基因灵敏度实验速度特殊设备ARMSYes0.1 1%+NodPCRYes1%+YesNGSNo？-Yes 对于初治NSCLC患者进行EGFR基因检测，组织或细胞学 标本是金标准，血液检测作为有利补充； 对于一线TKI治疗进展患者进行耐药检测，血液检测的重 要性将持续加强， 成为耐药检测的主要标本； 以数字PCR等为代表的下一代技术将更多贡献于血液检 测，特别是耐药突变（如T790M）的监测； 从定性到定量，从静态到动态的血液EGFR突变检测将成 为未来临床应用趋势；总结-II混合标记间质+特异