丙型肝炎病毒1b型5′端5223 bp半基因组扩增

1、丙型肝炎病毒1b型5端5223 bp半基因组扩增王小红，熊瑜琳，李俊刚，谭朝霞，胡亚君【关键词】丙型肝炎病毒Aplifiatinf5terinal5223bpfragentfhepatitisvirusgentype1b【Keyrds】HV;lngRTPR;heigene【摘要】目的：扩增丙型肝炎病毒(HV)1b型5端5223bp半基因组.要领：取5份HV1b血清标本，接纳3种RNA提取要领，比力几种逆转录酶及逆转录条件，拔取差异Taq酶举行长链RTNestedPR反响体系及循环条件的挑选和优化，使用最正确的模板提取要领及优化的RTPR反响条件扩增出5端长度为5223bp(5223bp)半基因

2、组.结果：Trizl法可以得到完备的RNA模板，得当长链的扩增；应用ReverTraAeaT酶和SuperSriptT，反响条件为4210in后，422in,482in，30个循环，然后75,10in；可得到完备的DNA模板；TaKaLaLATaqT和PlatinuTaqDNAplyeraseHighFidelity接纳两种扩增条件：94变性2in,9430s，6230s，724.5in,扩增30个循环；94变性2in，9415s，685in，扩增5个循环，然后9415s，685in(每个循环延伸10s)，扩增20个循环,末了72延伸10in，均可得到HV1b型5端5223bp半基因组的阳性结

3、果，TaKaLaLATaqT扩增结果最好；PR产物经核苷酸序列测定证明为HV1b型.结论：通过种种条件的优化，乐成地实现了5端半基因组的扩增，为下一步全长质粒及复制子的构建打下了底子.【关键词】丙型肝炎病毒；长链RTPR；半基因组0弁言丙型肝炎病毒(hepatitisvirus,HV)基因组是一单股正链RNA，全长约莫由9600核苷酸构成，是引起丙型肝炎的病原体.HV基因组具有显着的异质性，按照其核苷酸序列的差异，分为6个重要的基因型，50多个亚型及差异的HV分散株1.同时，HV以一群差异的但严密相干的变异株存在于患者体内，称为准种quasispeies.传统的HV全基因组质粒的构建通常接纳短

4、片断拼接而成2，海内有报道接纳4个片断扩增构建全长质粒3，比来外洋文献报道的全长基因组质粒的构建也多是接纳3个片断拼接而成4.这种短片断的拼接很轻易造成准种间的差异变异株的不真实毗连，使所构建的HV全基因组并不是现实存在的基因，限定了HV分子程度的研究.长链扩增可以最大限度地制止这种准种间不真实毗连，使所构建的HV全基因组质粒更为真实可靠.我们拔取中国HV重要盛行株1b型5为研究工具，创立了HV长链RTPR扩增要领，并得到了HV1b型5端5223bp半基因组，为下一步构建病毒全基因组质粒及中国人HV复制子奠基了底子.1质料和要领1.1质料HV1b型血清标本5份来自本科HV标本库，RNA程度为2

5、.9661091.2511010拷贝/L.QIAapviralRNAinikitQiagen公司；TRIzlLSReagent，RNaseUTRNA酶按捺剂，SuperSriptT反转录酶，PlatinuTaqDNAplyeraseHighFidelity，RNaseHInvitrgen公司；ViralPurifiatinKit(agExtratr，YYB公司)；DEP处置惩罚水上海生工生物技能；Blue/range6ladingDyePrega公司；GeneRuler1kbDNALadder,readytuse(Ferentas公司)；去离子水接纳美国illipre公司的illiQplus超

6、纯水仪制造；日立55P72低温超高速离心机Hitahi公司；PT225PeltierTheralyker热循环仪JRESEARH公司；GelD2000凝胶成像仪BiRad公司；试验所需的全部耗材均用美国Axygen公司消费的去DNA酶和去RNA酶处置惩罚过的耗材.1.2要领表1HVRNA5端扩增所用引物的序列和位置略*引物位置参照HVn1株(GenBank注册号为AJ238799).表2逆转录的反响条件略*:RNA混淆液65预温5in立即参加42的反响液，然后举行RT反响.2结果2.1长链RNA模板提取要领的挑选提取的5份血清标本RNA中，Trizl法提取的RNA举行E1及3UTR的扩增均可得

7、到阳性条带.QIAapviralinikit提取的RNA有2份标本同时得到阳性条带，别的均为E1扩增阳性，3UTR扩增阴性.磁珠吸附法提取的RNA均为E1区扩增阳性，3UTR扩增阴性.说明Trizl提取的模板3UTR的plyU布局未粉碎，完备性好，实用于长链的扩增图1.：DNAarkerladder(100bp)；13，5，6：HVE1区扩增产物；79，11，12：HV3UTR扩增产物；4，10：阴性比较；A：TRIzl法；B：QiagenRNA抽提试剂盒；：磁珠法.图1三种要领提取的RNA模板完备性断定略2.2HV长链RT要领的创立应用ReverTraAeaT酶和SuperSriptT，反响

8、条件为4210in后，422in,482in，30个循环，然后7510in.得到的RT产物举行5端半基因组扩增都得到过阳性结果.但SuperSriptT反转录的模板举行5端5223bp片断扩增的乐成率高于ReverTraAeaT酶.2.3长链PR要领的创立接纳长链nestedPR要领，选用TaKaLaLATaqT，在上述两种循环条件下，5份标本均可得到阳性条带图2，PlatinuTaqDNAplyeraseHighFidelity只有2份标本得到阳性条带，而ReverTraDashT未得到阳性条带.2.45端5223bp片断的得到使用上述优化条件，5份HV血清标本均得到5223bp长度的目的片

9、断图2，亮度高，未见非特异性扩增.PR产物奉上海生工生物技能完成核苷酸序列测定，通过与GenBank中全部1b型序列的比对及系谱阐发表现扩增产物为HV1b型.：DNAarker；1，2，46：血清标本；3：阴性比较.图2优化的长链RTPR法对HV1b型5223bp半基因组扩增产物电泳图略3讨论HV的长链扩增不停是国表里的难点，我们通过种种条件的优化乐成的实现了5端半基因组的扩增，为下一步全长质粒及复制子的构建打下了底子.【参考文献】1SindsP.ViralhetergenEityfthehepatitisvirusJ.JHepatl,1999，31(1):54-60.2SH,GarzinDe

10、A,Hng,etal.ExpressinfafulllengthhepatitisvirusDNAupregulatestheexpressinfhekinesP1andRANTESJ.Virlgy,2002,303(2):253-277.3毛红霞,胡芸文,吴瑛,等.丙型肝炎病毒全长DNA模板的构建及断定J.中华实行和临床病毒学杂志,2022，18(2):122-126.4SheehyP,Sallanb,KennyalshE,etal.AstrategyfrbtainingnearfulllengthHVDNAlnes(asseblins)byasseblyPRJ.JVirlethds,2022,123:115-124.5张帆，王小红，王宇明,等.重庆地域HV基因亚型的漫衍状态J.第四军医大学报,2022,26(14):1253-1256.7LuaL,Nak