CE概述、原理-PPT精选课件

1、高效毛细管电泳技术概述电泳的发展历史 电泳是一种带电粒子在电场中泳动的现象。电泳现象发现得很早，但将这种现象用于生物化学领域，尤其是临床医学和检验医学领域却是近几十年的事。20世纪6070年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。电泳的发展历史 电泳技术除用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶、甚至病毒与细胞的研究。由于电泳技术具有快速、简便、高分辨率及选择性等优点，电泳技术的种类逐渐增加，手段与仪器日趋完善，以致现在己成为检验医学常规分析、教学和科研中不可缺少的“常规武器”。电泳的发展历史 1809年，俄国物

2、理学家 Reuss 进行了世界上第一次电泳实验。他用两根玻璃管插入一块湿粘土中，容器灌满水，管底放一层沙，然后封闭起来并通电。其结果是连接阳极的管中的水由于胶体粘土颗粒通过沙层的电泳迁移而变得混浊，而连接阴极的管中的水变得清澈，并且增加了体积，显示了电渗（electro-osmosis）现象。1909年Michaelis把胶体离子在电场中的迁移定名为“电泳（electrophoresis）”。 电泳的发展历史 从19世纪初到 20世纪中的 150年中，早期电泳技术虽然得到了发展，但由于移界电泳装置比较昂贵，而且分辨率有限，同时因为溶液受热后发生密度变化，产生对流，使区带扰乱，故在 20 世纪

3、50 年代以后又发展了支持物电泳，如滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术。电泳的发展历史 这些方法，设备简单、操作方便，有很高的分辨率和选择性，所分离成分的检出可利用染色、紫外吸收、放射性测定、生物活性测定等，有高的灵敏度，特别是20世纪70年代后一些自动化仪器的相继出现与应用，使得电泳技术在生化研究和临床生化检验方面发挥了巨大作用。电泳的发展历史 20世纪2030年代，电泳技术的理论与实践有了很大发展。瑞典 Uppsala 大学的物理化学教授Svedberg和他的同事利用在长波紫外光激发时蛋白质发绿色荧光的现象，在电泳过程中对卵白蛋白进行照相。电泳的

4、发展历史 1937年Tiselius教授建立了移界电泳法（moving boundary electrophoresis），并利用其修改的U型电泳槽和电极装置首先证明了血清是由白蛋白、和球蛋白组成的，为此他于1948年荣获了诺贝尔奖。移界电泳技术的应用改变了许多陈旧的观念，使与蛋白质有关的研究更加深入，极大地促进了基础医学和临床医学的发展。 电泳的发展历史 以下列出电泳技术和装置的发展简史。不难看出电泳技术和装置是物理学家、化学家、物理化学家、生理学家和生化学家们等经过许多代人的共同努力才得以不断发展与成熟。 电泳的发展历史1809年Reuss进行第一次电泳实验19231924年Svedber

5、g在电泳时对带荧光的白蛋白照相1937年Tiselius建立移界电泳，并将血清分离成白蛋白和球蛋白， 被称为“电泳之父”，并于1948年获诺贝尔奖1939年Svensson使用圆柱形透镜系统1939年Konig报告了用滤纸作介质电泳分离蛇毒黄色色素的方法1948年Svensson提出了pH梯度理论1953年Grabar和Williams使用免疫电泳1959年Raymond和Weintraub使用聚丙烯酰胺凝胺作为电泳支持介质1961年Svesson提出两性电解质理论基础 1963年Hjerten进行不连续电泳1963年Fazekas将考马斯亮蓝用于纸、琼脂等的染色1965年Meyer将考马斯亮

6、蓝用于聚丙烯酰胺凝胶染色1966年瑞典LKB公司获得Ampholine专利电泳的发展历史1967年Shapiro进行SDS电泳1970年Laemm1i进行不连续SDS电泳1970年Helena公司设计推出快速扫描密度仪（quick scan densitometer）1972年Laurell进行火箭电泳1973年瑞典LKB公司推出水平电泳槽Multiphor I1975年Southern提出Southern Blot （DNA印迹法）1975年Farell提出聚丙烯酰胺凝胶双向电泳1979年Towbin提出Western Blot（蛋白质印迹法）1979年Merril、Switzer应用银染色

7、法1985年Mocremans应用金染色法1986年瑞典Pharmacia公司发明半干技术1989年Beckman公司P/ACE高效毛细管电泳仪诞生1994年Beckman公司P/ACE 5000高效毛细管电泳仪问世2019年Beckman公司P/ACE MDQ系列产品出现高效毛细管电泳概述 电泳分离是依据电场中溶质不同的迁移速率。在高效毛细管电泳（HPCE）中，电泳是在细毛细管中进行，管内径一般在25到75m之间，管内通常只充有缓冲液。使用毛细管有许多优点，尤其是考虑到焦耳热的不利影响。毛细管的高电阻能够在使用很高电场（100500V/cm）时只产生很少的热量。而且毛细管很大的表面积/体积比

8、能使产生的热有效地扩散。高效毛细管电泳概述 采用高电场导致了分析时间短、效率和分离度高。柱效率常常超过105理论塔板数，这部分是由于电渗流的塞状流型。电渗流是电泳中的一个现象，它引起溶液在毛细管内的整体流动。它也使所有溶质不论其带电情况的同时分析成为可能。此外HPCE具有不同分离机制和选择性的多种分离模式，很少的样品需要量（110 nl），柱上检测，以及定量分析和自动化的潜力，所有这些特点使得HPCE正在迅速成为一种极为有力的分离技术。高效毛细管电泳概述 HPCE的一个主要特点是仪器的整体结构简单。简言之，一根细内径弹性石英毛细管的两端置于缓冲液瓶中，瓶内溶液与管内溶液是相同的。两个缓冲液瓶中

9、都放置一个使高压电源和毛细管之间产生电接触的电极。样品引入到毛细管里是通过用一个样品瓶替换一个缓冲液瓶，并施加电场或者外部压力而实现的。重新更换回缓冲液瓶后，施加电场，分离便开始进行。光学检测可在毛细管的另一端直接通过管壁进行。本讲义将详细讨论进样，分离、检测、定量分析、仪器和自动化分析等等方面的理论和实践。电泳与色谱 毛细管电泳的基本原理就是电泳和色谱。电泳和色谱以不同的原理实现分离，但却有许多惊人的相似之处，比较它们的相似性，不仅有趣，而且有助于对毛细管电泳的理解。 （1）词义的双重性 电泳（electrophoresis）亦叫电迁移（electromigration），其宏观表现是介质的

10、导电。电泳一词原指带电粒子在一定介质中因电场作用而发生定向运动的物理化学现象，后来，电迁移现象被用于物质的分离，随之形成了一系列电泳技术或方法，这些方法通常也被简称为电泳。与此相仿，色谱（chromatography）一词不但指物质因在两相中分配（广义）并运动而发生分离或层析的现象，而且更经常地指运用这一现象进行物质分离分析的技术手段。电泳与色谱 （2）分离过程相类 电泳和色谱分离都是速差过程，可用相同的理论如物质传输理论来描述。 （3）分离模式相象 以分离后的区带特征为根据，电泳和色谱可分成对应的四类 ，如表1 ( P 2 ) 所示，其中第一类是其他各类的基础。 （4）仪器构成类同 包括进样

11、，分离，检测和数据处理等部分。 （5）分离通道的形状相类 有薄层、柱子、毛细管等。电泳与色谱 正是因为如此，电泳特别是毛细管电泳通常采用色谱中的一些概念或名词，比如分离效率（N），理论塔板，保留时间（tR）等等。也正是因为如此，毛细管电泳才能把电泳和色谱统一起来，变成一种新的方法。 毛细管电泳分离模式 毛细管电泳可以分为许多种不同形式，一般根据它们分离模式将其分为不同的类型，兹将它们列于表 2， P 2, 以供参考。 毛细管电泳的特点 毛细管电泳通常使用内径为25100m的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管，标准毛细管的外径为375m，有些管的外径为160m。毛细管的特点是： 容积小（一根100c

12、m75m管子的容积仅4.4l）； 侧面/截面积比大因而散热快、可承受高电场（1001000V/cm）； 可使用自由溶液、凝胶等为支持介质； 在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。毛细管电泳的特点毛细管电泳具备如下优点：高效 效率在105106片/m间，CGE效率可达107片/m以上；快速 几十秒至十几分钟完成分离；微量 进样所需的体积可小到1l，消耗体积在150nl间；多模式 可根据需要选用不同的分离模式（表1-3）且仅 需一台仪器；样品对象广 从无机离子到整个细胞，具有“万能”分析 功能或潜力；经济 实验消耗不过几毫升缓冲溶液，维持费可用分人 民币计算；自动 CE是目前自动化程度最高的分离方法

13、；洁净 通常使用水溶液，对人对环境无害。毛细管电泳的特点毛细管的不足：制备能力差；光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；凝胶、色谱填充管需要专门的灌制技术；大的侧面/截面积比能“放大”吸附的作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰；吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚难以定量控制电渗。 通过与双向电泳（2-DE）和高效液相色谱（HPLC）等的比较，可以对CE获得更细致了解。CE的分离效率、分析速度、消耗、应用范围、定性定量功能等都远远超过2-DE，但峰容量和制备水平则差得多。和HPLC相比，CE的应用面广得多，效率、峰容量高得多，操作费用和环境污染则低得多，但制备能力也差得多。目

14、前的发展状态 HPCE是一种迅速发展的分离技术，其最大的优点之一是应用范围广泛。最初人们主要考虑它用在生物大分子的分析方面，现在已经证明它能用于分离多种化合物，诸如氨基酸、手性药物、维生素、杀虫剂、无机离子、有机酸、染料、表面活性剂、肽和蛋白质、糖类、低聚核苷酸和DNA限制性内切片段，甚至整个细胞和病毒颗粒。 高效毛细管电泳理论 HPCE可以看作是电泳的一种仪器化方式。通过利用毛细管代替平板凝胶所获得的分离效率方面的提高在许多方面类似于使用柱代替板床方式进行色谱分离所产生的效果。另外，HPCE使得分离机制大大扩展，从而拓宽了电泳的应用范围。如今电泳不再局限于分离大分子，它还可以在一次分析中实现

15、阳离子，阴离子以及中性物质的同时分离。高效毛细管电泳理论 电泳的分离是以电场中溶质的速度差异为基础。一种离子的迁移速度可用下式表示： V=eE （1）其中： V=离子迁移速度 e=电泳淌度 E=电场强度 高效毛细管电泳理论 电场强度是外加电压和毛细管长度的简单函数（单位为V/cm）。对于给定的离子和介质，淌度是该离子的特征常数。 何谓淌度？淌度由分子所受的电场力与其通过介质时所受的摩擦力的平衡所决定。即 电场力（FE） e - （2） 摩擦力（FF）高效毛细管电泳概述电场力可以写成： F = q E （3）而摩擦力（对于球形离子）为： F = 6rv （4）这里： q = 离子电量 = 溶液粘

16、度 r = 离子半径 v = 离子速度高效毛细管电泳概述 在电泳过程中，可以达到由上两力的平衡所决定的稳态。此时，两种力大小相等而方向相反： qE=6rv （5） 对速度求解并将公式（5）代入公式（1）,可以得到一个以物理参数表示淌度的公式： 电场力（FE） e - （6） 摩擦力（FF） 高效毛细管电泳概述 上式表明，带电量大的物质具有的淌度高，而带电量小的物质淌度低。 通常从标准表中查到的电泳淌度是一个物理常数，它是在溶质带最大电量时测定并外推至无限稀释条件下所得到的数值。它往往不同于实验测定值。因此后者被称为有效淌度，一般依赖于操作缓冲溶液的pH（即，溶质pKa）和组成。 高效毛细管电泳

17、概述 绝对淌度和有效淌度之间存在差异。两种假定的溶质在完全离子化状态下，具有相同的电泳淌度。在淌度表中，它们表现为因没有差速迁移而不能得到分离。但是，它们具有不同的pKa值,从而因其依赖pH的电量不同而具有不同的淌度。电 渗 流（EOF） HPCE操作中一个基本的组成部分是电渗流（EOF）。电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。电渗流通过对溶质淌度叠加一个体相流速来控制溶质在毛细管内停留的时间。这可能影响必需的毛细管长度，但不影响选择性。 电 渗 流（EOF） 在水溶液中，多数固体表面带有过剩的负电荷。它们的来源可以是表面的离子化（即，酸碱

18、平衡）和表面对离子物种的吸附。对于石英，尽管电渗流强烈地受可能以阴离子方式存在（SiO）的硅羟基（SiOH）的控制，但上述两种过程都有可能存在。虽然石英的确切pI难以测定，但电渗流在pH4以上确实变得非常显著。非离子材料如聚四氟乙烯也可以产生电渗流，可能是由于它们对阴离子的吸附。 电 渗 流（EOF） 为了保持电荷平衡，对离子（多数情况下是阳离子）在靠近表面处积聚，使得从双电层到离壁很近的地方之间产生了一个电位差，称为Zeta电位。向毛细管两端施加一个电压，组成扩散层的阳离子将被吸引到负极。由于这些离子是溶剂化的，它们将拖着毛细管中的体相溶液向负极运动。电 渗 流（EOF） 电渗流的大小可用速

19、度或淌度来表示：或 VEOF=(/)E (7) EOF =/ (8) 其中：VEOF=速度 EOF=电渗淌度 =zeta电位 =介电常数（注意：淌度与外加电场无关）电 渗 流（EOF） zeta电位主要是由毛细管表面电荷所决定的。由于电荷量受 pH控制，电渗流的大小也随pH变化。在高pH下，硅羟基大量解离，电渗流将比低 pH下硅羟基质子化时高得多。在特定的场合，pH 从 2到 12电渗流的大小变化可能会超过一个数量级。 Zeta电位还取决于缓冲溶液的离子强度。双电层理论表明，增加离子强度可使双电层压缩，Zeta电位降低，从而减小电渗流。 电 渗 流（EOF） 毛细管内电渗流的一个独特性质是其具

20、有平面流型，由于引起流动的推动力沿毛细管（在管壁处）均匀地分布，不会在毛细管内形成压力差，所以流速到处接近相同。平面流型的优点是它对区带的分散没有直接的贡献。这同由外部泵驱动的因管壁处存在剪切力而产生的层流或抛物线流型形成了对照。电 渗 流（EOF） 流速在管壁附近迅速减小。这一静止的溶液层是由管壁表面对流动的摩擦阻力所引起的。由于该层向溶液中延伸的距离很短，它对整个分离过程的影响并不得要（以其它分散过程为主）。另外，流速和流型一般与毛细管内径无关，但如果毛细管内径太粗（200300微米），流型会被扰乱。流型对峰形的影响。 电 渗 流（EOF）电渗流的另一优点是它可以使几乎所有物种，不论其电荷

21、性质如何，向同一方向运动。在一般情况下（带负电的毛细管表面），电渗流的方向是由正极到负极。由于电渗流可以比阴离子的淌度大一个数量级，它可以将阴离子推向阴极。所以，阴离子，中性物质以及阳离子可以向同一方向“迁移”而在一次分析中得到电泳分离。其中，阳离子迁移最快是因为其迁移与电渗流同向，中性物质也可以随电渗流迁移但彼此不能分离，而阴离子则因为其迁移与电渗流反向而速度最慢。 电 渗 流（EOF） 对于小离子的分析（如K+，Na+, Cl-）,电渗流的大小往往不比溶质的淌度大。另外，对毛细管内壁表面电荷进行修饰可以减小电渗流，而溶质的淌度则不受影响。在这些情况下，阴阳离子可以向不同的方向迁移。电 渗

22、流 的 控 制 电渗流通常是有利的因素，有必要对它进行控制。例如，在高 pH 下，电渗流可能太快，使溶质在未得到分离之前就被推出毛细管。相反，在低 pH 或中等 pH，负电表面可能会通过静电作用吸附阳离子溶质。后一现象在碱性蛋白质的分离中成为特别严重的问题。除此之外，在等电聚焦，等速电泳以及毛细管凝胶电泳中常常要求减小电渗流。 电 渗 流 的 控 制 一般来说，电渗流的控制要求对毛细管表面电荷或缓冲溶液粘度进行调节。表4，P 9 所列和下面几段中论述的几种方法可以达到这一目的。但请注意，影响表面电荷的因素往往也会影响溶质（如缓冲溶液 pH ）。在电渗流和溶质淌度性质得到优化的条件下，可以实现成

23、功的分离。 电 渗 流 的 控 制 公式（7）表明，可以简单地降低电场强度来减小电渗流速度。但是这一方法存在着分析时间、分离效率和分离度方面的缺陷。从实用的观点来看，通过调节缓冲溶液的 pH也可以引起 EOF的急剧变化。然而，改变 pH 可能会影响到溶质的电荷和淌度。低 pH 缓冲溶液会使毛细管表面和溶质质子化，而高 pH 则促使它们解离。对于溶质pI的了解将有助于选择合适的操作缓冲溶液的pH范围。 电 渗 流 的 控 制 通过调节缓冲溶液的浓度和离子强度也可以改变电渗流。高离子强度缓冲溶液可以通过减少管壁上的有效电荷来限制溶质与管壁的静电相互作用。但高离子强度缓冲溶液的使用将受到毛细管内的热

24、效应的约束。尽管可以使用100500mM甚至更高的浓度，但一般缓冲溶液的浓度为1050mM。 电 渗 流 的 控 制 最后，还可以通过对毛细管壁以动态的涂渍（缓冲溶液添加剂）或共价键合的方式进行改性处理来控制电渗流。这些涂层，可以增加、减小或反转表面电荷，从而改变电渗流。 分 析 参 数 毛细管电泳中的分析参数可以用色谱中类似的术语加以描述。毛细管区带电泳是HPCE中最简单的方式，本节中所有后续的讨论都是关于CZE方式的。下面将讨论关于时间、淌度、样品区带分散、分离效率和分离度的理论和实用方面。 淌度和迁移时间 一种溶质迁移至检测点所用的时间称为“迁移时间”，它等于迁移距离除以速度。迁移时间和

25、其它实验参数可用于计算溶质的表观淌度： a=1/tE = 1L/tV （9）其中： a=e+EOFV=外加电压I=毛细管有效长度（到检测器）L=毛细管总长度t=迁移时间E=电场强度淌度和迁移时间 在电渗流存在的情况下，测得的淌度称为表观淌度，a。可以通过用一种中性标记物单独测定电渗流的方式，自表观淌度中扣除电渗淌度而求得溶质的有效淌度。可以使用的中性标记物有二甲亚砜（DMSO），异亚丙基丙酮（mesityloxide）和丙酮等。 淌度和迁移时间 有效长度指的是从进样点到检测点之间的距离。对于柱上（On-Column）光度检测来说，毛细管有效长度一般比其总长度短5-10cm。而在柱后检测方式下（

26、如质谱），两个长度相等。由于迁移时间和淌度是由有效长度确定的，而电场强度是由总长度确定的，对两个不同长度的了解是非常重要的。分 散 过 程 电泳分离以溶质淌度的差异为基础。分离两个区带所必需的淌度差异取决于区带的长度。而区带长度则同作用于区带上的分散过程密切相关。由于分散过程增加区带的长度和实现分离所必需的淌度差异，有必要对分散过程进行控制。 分 散 过 程 分散，即溶质区带的展宽，来源于该区带中溶质的速度差异，可定义为峰底宽度，Wb。对于一个高斯峰。 Wb=4 （10） 这里=峰的标准偏差（以时间，长度或体积表示） 以理论塔板数表示的分离效率，N，可从下式求得： N = ( 1/)2 （11

27、）其中： 1 =毛细管有效长度分 散 过 程 分离效率与理论等板高度（HETP），H，之间的关系如下： H = ( 1/ N) （12）分 散 过 程 在理想条件下（进样塞较小，没有溶质管壁相互作用等等），可将纵向（沿毛细管）扩散视为HPCE中对样品区带展宽有贡献的唯一因素。由于流型呈塞状，径向扩散（横穿毛细管）不太重要。同样，由于毛细管的抗对流性质，对流引起的区带展宽也不明显。 影响分离效率的因素 在HPCE中，除了纵向扩散之外，其它因素也会引起区带分散。这些因素中，最重要的有焦耳热引起的温度梯度，进样塞长度以及溶质与毛细管壁的相互作用。值得庆幸的是，这几种因素都是可以控制的。它们与其它因素

28、引起区带扩展的机制列于表6，P 6。 焦耳热和温度梯度在细孔径毛细管内进行电泳的一个主要的好处就是减小了曾限制传统电泳技术的热效应。热效应可以导致不均匀的温度梯度和局部的粘度变化从而引起区带展宽。虽然分离效率和分离度的理论公式中提倡使用尽可能高的电场强度，但不论毛细管的尺寸和温度控制措施如何，升高场强所带来的收获将最终受到焦耳热的限制。 焦耳热和温度梯度 因电流通过而产生的热称为焦耳热。温度的上升与产生的功率（电压与电流之积）有关，并由毛细管尺寸，溶液的电导和外加电压所决定。当功率的产生超过散逸时，温度就会急剧升高。一般功率的产生在0.5-5W/m范围之内。温度升高10是很平常的，有时甚至可升

29、高70或更高。焦耳热和温度梯度 虽然温度的绝对升高并无妨碍（除非可能引起样品分解等），但温度梯度却是有害的。毛细管壁的热散逸会使毛细管中心温度高于管壁温度。这一温度梯度将引起操作缓冲溶液的粘度变化从而导致区带变形。由于温度每变化1引起的粘度变化为2-3%（淌度也变化2-3%），控制温度梯度是非常关键的。焦耳热和温度梯度 有许多方法可用于显示过热和温度梯度的存在。比如可以利用升高电压以后分离效率的降低来说明过热现象的产生。另一种迹象是在高电压下EOF或溶质淌度的非线性增加。同样，电流随电压的非比例变化也可以表明温度的升高（偏离欧姆定律）。焦耳热和温度梯度 表8列出了可以限制焦耳热的各种方法。公式

30、（17）表明温度梯度将随功率的减小而线性降低。这可以通过降低外加电压或减小缓冲溶液电导（降低离子强度或缓冲离子淌度）的方法来实现。后一方法虽然有效但有实用方面的限制。降低缓冲溶液浓度可能减小缓冲容量并导致溶质和管壁的相互作用。焦耳热和温度梯度 另一种选择是使用低淌度缓冲溶液，它们具有较大的弱电解质离子，如三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），硼酸盐，组氨酸和3-环己氨基-1-丙磺酸（CAPS）等。关于缓冲溶液的选择将在3.1.1.1节讨论。焦耳热和温度梯度 还可以通过减小毛细管内径来实现温差的急剧降低，因为面积（电流）与半径的平方有关。内径细到5-10m的毛细管已经得到了应用，但在这种内径的毛细管

31、中，检测、进样以及毛细管的堵塞等问题的存在，使得它们不能用于日常分析。更实用的是25-50m内径的毛细管。 焦耳热和温度梯度 自毛细管外壁驱除热量极端重要。可以简单地利用风扇吹动毛细管周围的室温下的空气来达到这一目的。使用高速流动的空气或液体对毛细管恒温的冷却系统可以大大改善冷却效果。从理论上使用液体更为有效（k液k空气），但在一般条件下，生热低于5-7W/m时，高速空气冷却也同样有效。Beckman Coulter公司毛细管电泳仪使用冷冻剂。焦耳热和温度梯度 主动的温度控制对散热和保持毛细管温度恒定至关重要。即使在没有焦耳热效应的情况下，室温的变化也会引起粘度变化（2-3%/）从而改变迁移时

32、间。另外，由于进样过程也与温度有关，较小的温度变化可能对进样量造成明显的影响。有关控温和重现性的进一步讨论见第4章。 进 样 塞 长 度 在进样过程中，减小样品塞长度非常重要。如果其长度超过因扩散造成的区带分散，分离效率和分离度将受损失。 进样塞长度与扩散系数之间的关系及其对分离效率的影响列于表9，P 15。进 样 塞 长 度 对进样长度的一个实用的限制是低于毛细管总长度的1-2%。对于70cm长的毛细管，1%长度相当于7mm（或14nl,50m内径时）。虽然目前使用仪器可以重现地将如此少量的样品引到毛细管中，但在一般情况下，检测限方面的困难需要更长些的进样长度。在不损失分离效率的情况下改善检

33、测限的措施将在第2章，4.1.3节，4.3节中讨论。溶质与管壁相互作用 溶质与毛细管之间的相互作用对HPCE极其有害。在不同的相互作用程度下，可能会出现拖尾峰甚至发生对溶质的完全吸附。引起毛细管壁对溶质吸附的主要原因是阳离子溶质与负电表面之间的离子相互作用和疏水相互作用。毛细管的高表面容积比对传热来说是有利的，但也增加了产生吸附的可能性。已经注意到，对多肽和蛋白质来说这种吸附作用特别严重，主要是因为这类分子具有较多的电荷和疏水基团。 溶质与管壁相互作用 可以采取多种对策来减小溶质管壁相互作用。其中几种简便易行且有特殊效果。例如，增加缓冲溶液浓度可以降低有效表面电荷来减小溶质管壁相互作用。高离子强度也可以降低电渗流，因此增加了溶质在毛细管中的停留时间。但是，这种尝试往往受到因电流增加而引起的焦耳热的限制。为此可以选择使用两性离子缓冲体系。溶质与管壁相互作用 限制吸附的另一种尝试是在极端pH下进行分离。在低pH下（2-3），石英表面硅羟基主要以不带电的形式存在。尽管此时电渗流接近为零，但因蛋白质（和其它溶质）也可以质子化而带正点荷，它们仍可向负极迁移。相反，在高pH下（910），毛细管壁和溶质都将解离而带负电，溶质管壁相互作用则因电荷之间的排斥而