第一章组织培养基本原理和设施ppt课件

1、 第一章 根本原理和设备 一、植物组织培育的根本原理 1.植物细胞全能性 植物细胞的全能性：植物细胞的全能性是指植物体的每个具有完好细胞核的细胞，都具有该植物的全部遗传信息和发育成完好植株的潜在才干。 原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完好个体所必需的全部基因，从实际上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 两个含义：1植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息.2每个植物细胞均具有发育成完好植物体的潜在才干. 差别：1 受精卵的全能性最高 2 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的缘由：基因表达的选择性 科

2、学研讨阐明，处于离体形状的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就能够表现出全能性，发育成完好的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培育。 2、植物细胞的分化 植物细胞分化是指点致细胞构成不同构造，引起功能改动或潜在发育方式改动的过程。 植物细胞分化是多细胞生物体形状发生的根底。 植物个体的发育是植物细胞不断分裂、生长和分化的结果。在整个植物生长发育过程中，由于顶端分生组织活泼分裂的结果，经过一系列复杂的形状发生过程，构成不同的器官和组织，即在植物体内分化出了各种不同类型的细胞群。从而使植物体的成熟部分具有了复杂的内部构造，最后开花结实完成其生活史。 细胞分化在植物

3、形状建成中是一个中心问题，没有细胞的分化就没有形状建成。 细胞分裂、生长、分化是生物体发生的三个根本景象。 细胞分化的结果：导致形状发生，从而构成不同器官，不同器官又执行着不同功能。 植物的每个生活细胞具有全能性，但任何一个细胞在其整个生活周期中，只能表达其基因库中的极小部分内容，而各个细胞在不同的时间、空间和内外条件下，表达的内容是不同的，因此就出现了机能和形状的差别。所以，分化也可说是一个基因型的细胞所具有的不同的表现型。 细胞的构造和功能的不同或发育方式的不同，从而产生分工的不同。 在系统发育上，植物越进化，细胞分工越细致，细胞的分化就越猛烈，植物体的内部构造也就越复杂。 细胞分化是一个

4、复杂的问题，同一植物的一切细胞均来自于受精卵，它们具有一样的遗传物质，但它们却可以分化成不同的形状；即使同一个细胞，在不同的内外条件下也能够分化成不同的类型。细胞的极性、细胞在植物体中的位置、细胞的发育时期、各种激素和某些化学物质，以及光照、温度、湿度等物理要素都能影响分化。 所以我们可以经过人为的控制，使得分化的结果可以满足人们的需求。 在分化的控制上，激素的调理作用是非常重要的。但调控因子是非常复杂的，另外像外界环境因子(光、温度等)及细胞和组织内本身的启动和支配，都能影响到细胞分化。3.植物激素在形状建成中的作用 植物激素是指自然形状下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显

5、著作用的微量有机物。 植物激素是培育基的关键物质，对植物组织培育起着非常重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、零落酸、乙烯及人工合成的植物生长调理剂。 植物生长调理物质植物激素植物生长调理剂在植物组织培育中运用的生长调理物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培育基中还添加赤霉素GA3等。1种类IAANAAIBA2,4D 2作用： 诱导愈伤组织构成，体细胞胚的产生，以及诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。 生长素配合一定比例的细胞分裂素对于器官的构成和植株再生可以起到调控作用，它们的比例决议着发育的细胞类型，决议着愈伤组织再分化，是长根还是长芽 。生长素/

6、细胞分裂素的比值高，有利于根的构成和愈伤组织的构成；比值适中时，有利于根芽的分化；比值低时，有利于芽的构成。 根对生长素最敏感，在极低浓度下就可促进生长，其次是茎和芽。 1、生长素 (auxin)IAA(吲哚乙酸) 是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官构成的 副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸) 在组织培育中的起动才干要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以运用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA(吲哚丁酸) 是促

7、进发根才干较强的生长调理物质。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸) 起动才干比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的构成上活力最高，但它剧烈抑制芽的构成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生长素配制可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。留意：天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易遭到体内酶的分解。组织培育中常用人工合成的生长素类物质。2 细胞分裂素类 这类激素是腺嘌呤的衍生物，细胞分裂素有激动素(KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(ZT)、2异戊烯腺嘌呤2i

8、p和6-苄基腺嘌呤BAP等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。在培育基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导愈伤组织、不定芽和不定胚的产生 。细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩展。促进细胞分裂与器官分化、延缓组织衰老，加强蛋白质合成诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖。抑制根的分化。防止在生根培育时运用。3 GA(赤霉素) 种类：种类多，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培育基中添加的是GA3。作用：主要用于促茎伸长，促胚发育成植株；突破休眠赤霉素和生长素协同作用，对构成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值

9、高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。赤霉素还用于突破休眠，促进种子、块茎、鳞茎提早萌生等。 特性：赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，该当采用过滤灭菌法参与。 零落酸ABA在组织培育中很少运用。有些例子阐明，加在培育基中的零落酸，或是能促进愈伤组织的生长，或是能抑制它的生长，其作用因物种而不同，在胚培育中，零落酸能抑制胚的早熟萌生，促进晚期胚胎的正常成熟。另外，在植物种质资源超低温冷冻保管时，可以用来促使植物停顿生长和抗寒力的构成，从而保证冷冻保管的顺利进展。 乙烯对组织培育物芽的诱导和构成有促进或抑制造用，这与植物种类及处置时

10、间有关。如乙烯和二氧化碳的相互作用对针叶树芽的诱导有较大影响。 二、植物组织培育的常用设备、设备及培育环境 在进展植物组织培育任务之前，首先应对任务中需求哪些最根本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。 实验室的大小取决于任务的目的和规模： 1. 以工厂化消费为目的，实验室规模太小，那么会限制消费影响效率。 2. 在设计组织培育实验室时，应按组织培育程序来设计,防止某些环节倒排，引起日后任务混乱。 植物组织培育是在严厉无菌的条件下进展的。要做到无菌的条件，需求一定的设备、器材和器具，同时还需求人工控制温度、光照、湿度等培育条件。 组培的技术道路：外植体愈伤组

11、织不定芽生根再生植株根本的工艺流程： 容器具洗涤，物质预备配置培育基并灭菌外植体消毒与无菌操作接种察看、记录、处置脱分化、再分化、继代 再生植株实验室设计原那么：保证无菌操作，到达任务方便，防止污染。实验室组成： 预备室、无菌操作室、培育室、温室。 一根本设备1、预备室 在预备室主要进展一些常规的实验操作，如植物组织培育中所需器皿和其它仪器的清洗、枯燥和保管，培育基的制备和灭菌，常规的生理生化分析等。植物组织培育中常用的化学试剂、玻璃器皿也存放在这里。 假设房间较多，可将预备室分为洗涤室和培育基配制室两部分。洗涤室专门担任试管苗出瓶与培育器皿的清洗任务；培育基配制室那么担任培育基的配制、分装、

12、包扎和高压灭菌等任务。 预备室里通常摆放着植物组织培育中常用的仪器设备，包括普通天平和分析天平、低温冰箱假设无低温冰箱，普通冰箱也可、水浴锅、磁力搅拌器、高压灭菌锅、烘箱、酸度计、恒温培育箱、微波炉和电磁炉，还应配备放置药品和玻璃仪器的橱柜。在没有细胞学实验室作为配套实验室的情况下，植物石蜡切片和组织染色的设备也放在这里，如石蜡切片机、恒温箱、烘片箱和染色缸等。显微镜、体视显微镜等可以放在无菌操作室内，这样才满足对培育资料生长情况记录的要求。 可见，预备室要有足够的空间和一个较大的任务台，以满足植物组织培育中培育基的制备、资料处置和实验察看研讨等任务。植物组织培育研讨离不开拍照，还需配备光学相

13、机或数码相机。2. 无菌操作室 植物组织培育的无菌操作是进展植物资料的消毒、分别接种以及培育物的继代转移操作的场所。 超净任务台是无菌操作室的主要设备。超净台的优点是操作方便自若，比较温馨，任务效率高，预备时间短。 陈列于操作室接种室中类型：垂直式和程度式作用：无菌操作用3、培育室：是接种的资料培育生长的场所。 其设计以充分利用空间和节省能源为原那么。 主要设备：培育架控温控光控湿、空调、摇床、培育箱、紫外光源等。 培育条件：T252 ；L10006000Lx； t10-16 h/d ；70RH80% 维护方法：清洁、卫生，坚持一定空气干净度。4. 温室 在具备温室条件的地方，可以在温室栽培资

14、料，供植物组织培育取材只用。温室为植物提供良好的生长环境，可以根据需求随时栽培，也可以为组织培育提供安康的植物资料，从而使初代污染得到有效控制。同时，温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所，温室内应配置有温度控制安装、通风口、喷雾安装、光照调理安装、杀菌杀虫工具及相应药剂等。二主要仪器和设备 1、常用设备1 无菌操作设备 包括超净任务台、高压蒸汽灭菌和烘箱等。 灭菌锅陈列于灭菌室中类型：普通医用消毒锅大的高压灭菌锅作用：培育基、水和各种器皿的消毒仪 器 设 备高压灭菌锅手提式灭菌锅 烘箱陈列于洗涤室作用：枯燥洗后的器皿 高温干热灭菌 测定培育物的干重烘 箱2培育设备 培育设备是为培育物发明适宜

15、的光、温、水、气等条件的设备. 空调 加湿器或去湿机。 定时器。 培育架。 摇床或旋转床 恒温恒湿光照培育箱。3药品储存和配制仪器设备 冰箱。 天平。 酸度计。 微波炉或电磁用以融化琼脂。 冰 箱陈列于制备室中作用：低温保管资料，存放药品、培育基母液、激素、酶制剂。 天 平陈列于制备室中作用：称取大量元素、微量元素、 酶制剂酸度计陈列于制备室中作用：测定培育基及酶制剂的值PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计 4察看分析仪器设备陈列于察看室中类型： 体视显微镜 用以植物组织形状分化的实 体察看，不定芽、不定胚的早期识别，植物茎尖的切取 倒置显微镜 原生质体察看 普通显微镜 染色体和叶

16、片气孔察看 荧光显微镜 细胞活力察看 解剖显微镜 立体察看需配备光学相机或数码相机。 5其他仪器设备 离心机。进展原生质体分别时，需求离心机。 蒸馏水制备安装。需求时，还可进展重蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水。 除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾干架等也是植物组织培育中所需求的 .2. 主要器皿1培育器皿 培育用的玻璃器皿要求透光度好，能耐高压蒸汽灭菌。根据培育目的和要求不同，可采用不同种类和规格的玻璃器皿。 普通用：试管 、三角瓶锥形瓶、果酱瓶或罐头瓶、培育皿 、植物组织培育公用容器 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培育基枯燥和杂菌污染。 以前封口常用棉塞。不过这种封口

17、方法夏季极易污染，且不易坚持培育基湿度。如今多采用聚丙烯塑料膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。也可采用公用的封口资料如封口膜。2 分注器 运用分注器的目的是将培育基定量地注入到培育皿中。分注器有注射器分注器、漏斗式分注器、量筒式分注器等类型。3 离心管 离心管用于离心，将培育的细胞或制备的原生质体从培育基中分别出来，并进展搜集。4 其他玻璃器皿 主要是量筒、量杯、烧杯、吸管、滴管、容量瓶、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、酒精灯等用于配制培育基、贮藏母液、资料消毒等的各种化学实验玻璃器皿。3. 器械类镊子类剪刀类3解剖刀接种针5细菌过滤器 3.调控组织培育的主要环境条件 在植物组织培育中温度、光照、湿

18、度等各种环境条件，培育基组成、PH值、浸透压等各种化学环境条件都回影响组织培育育苗的生长和发育。 培 养 条 件 温度1、温度temperature) 温度是植物组织培育中的重要要素，大多数植物组织培育在2327之间进展，普通采用252。 低于15时培育，植物组织会表现生长停顿， 高于35时对植物生长不利。 但是，不同植物培育的适温不同。月季的最适温度是2527、番茄是28。温度不仅影响植物组织培育育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的构成以28为最好，在12以下，33以上构成率皆最低。培 养 条 件 温度 不同培育目的采用的培育温度不同： 百合鳞片在30以下再生的

19、小鳞茎的发叶速度和百分率比在25 以下的高。 桃胚在2条件进展一定时间的低温处置，有利于提高胚培育成活率。 用35处置草莓的茎尖分生组织3d，可得到无病毒苗。培 养 条 件 2、光照light 组织培育中光照也是重要的条件之一， 光强 主要表如今 光质 光照时间 培 养 条 件 光 照1光照强度light intensity) 光照强度对培育细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研讨情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。 光照强度：1000lx5000lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化 百合原球茎：黑暗下长出小球茎，照顾下长出叶片培 养 条

20、 件 光 照2光质light wave) 光质对愈伤组织诱导，培育组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培育，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培育，十几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培育首先出现芽，构成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝光妨碍培 养 条 件3光周期light period) 试管苗培育时要选用一定的光暗周期来进展组织培育，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 研讨阐明，对短日照敏感的种类的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄，茎切段培育在短日照下构成根。 培 养 条 件

21、3、湿度humidity) 湿度的影响包括培育容器内湿度的坚持和环境的湿度条件。 1 容器内湿度程度主要受培育基水分含量和封口资料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季该当适当减少琼脂用量，否那么，将使培育基干硬，以致不利于外植体接触或插进培育基，导致生长受阻。封口资料直接影响容器内湿度情况，但封锁性较高的封口资料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。培 养 条 件 2 环境的相对湿度可以影响培育基的水分蒸发，普通要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调理湿度。湿度过低会使培育基丧失大量水分，导致培育基各种成分浓度的改动和浸透压的升高，进而影响组织培育的正常进展。湿度过高时，易引起棉塞长霉，呵斥污染。培 养 条 件 4、浸透压penetrating pressure) 培育基中由于有添加的盐