DB4117∕T 320-2021 动物病原微生物实验室菌种保存和活化技术指南

1、 ICS 65.020.99CCS B404117驻 马 店 市 地 方 标 准DB4117/T 3202021动物病原微生物实验室菌种保存和活化技术指南2021-09- 29发布2021-10-29实施 DB 4117/T 3202021前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件为首次发布。I DB 4117/T 3202021动物病原微生物实验室菌种保存和活化技术指南1范围本文件规定了动物病原微生物实验室常用的菌种保藏和活化的术语和定义、要求、标准菌株菌种获取、菌种保存、菌种活化和记录。本文件适用于动物病原微生物实验室菌种的保

2、存和活化。本文件所述动物病原微生物实验室以下均简称为实验室。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T 27476.1检测实验室安全第1部分：总则SN/T 2660食品微生物实验室菌种保藏方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.2菌种可以培养的有一定科学意义或实用价值的细菌、真菌、病毒、细胞等代表株。样本人工采集的、经鉴定具有保藏

3、价值的含有动物病原微生物的体液、组织、排泄物、分泌物、污染物等物质。3.3病原微生物能够使人或者动物致病的微生物。3.43.5菌种保存将微生物菌种用各种适宜方法妥善保存，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。菌种活化菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养得到纯而壮的培养物。1 DB 4117/T 32020213.63.7标准菌株直接从有资质的菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株，按菌株特性进行分类和描述。代将微生物接种至新鲜培养基上或其中，每萌发一次即称一代，未开启原包装的标准菌株通常视为第 0代。4基本要求4.1动物病原微生物的保存和活化应符合实验室生

4、物安全通用要求等国家强制标准及相关政策法规要求。4.2针对动物病原微生物菌种特性选择适宜的保存方法，宜采用两种或两种以上的方法保存，以保持菌种的原有性状稳定和避免损失。4.34.44.54.64.7动物病原微生物菌种保存所使用的器皿要求清洁、透明、无破损、无裂痕。根据动物病原微生物菌种保存需要选择适合培养基。动物病原微生物菌种保存过程中应注意无菌操作，避免污染。动物病原微生物菌种培养至稳定期或成熟期后进行保存。动物病原微生物菌种保存期间，要定期检查菌种存放设施的温度和湿度、菌株有无污染、绵塞有无霉变，如有异常应重新移植培养后更换。4.85动物病原微生物菌种保存工作不能对周围环境造成污染和危害。

5、标准菌种获取5.1获取途径5.1.15.1.2标准菌种的获取可通过国家级菌种保藏中心或省级保藏中心获取。从上级机构下发的质控盲样中分离出的菌株，被证明结果是正确的、且从考核机构获得该菌种的保藏机构名称缩写及菌种编号的，也可作为标准菌株使用。5.1.3从其他有效的，经过资质认证的商业机构获得原包装的标准菌种。5.2验收实验室应制定标准菌株验收控制程序，确认供货商资质及来源，确保所获取的标准菌株满足要求。标准菌种保存5.3通常情况下，应按照制造商提供的使用说明进行保存。6工作菌种保存方法定期移植法6.16.1.1适用范围适用于大多数细菌和真菌。2 DB 4117/T 32020216.1.2操作步

6、骤定期移植方法操作步骤如下：a)接种：以无菌操作将菌株纯培养物接种到固体培养基（斜面）或液体培养基中，接种固体培养基可采用点接、划线或穿刺等方法。b)c)培养：在所保存菌种的最适培养条件下将细胞培养至稳定期或成熟期，并进行纯度检查。保存：培养好的菌种于46保存，需室温保存的菌种在室温（25）下保存。保存培养基一般含较多的有机氮，糖分总量不超过2%。6.1.3保存周期每3-6个月移植一次。有特殊要求的按其规定移植。易保存于相对湿度为50 %70 %的环境中。6.2液体石蜡法6.2.1适用范围适用于部分在有氧状态下生产良好的细菌、酵母、霉菌及放线菌。6.2.2操作步骤液体石蜡法操作步骤如下：a)灌

7、入石蜡：将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入刚培养好的新鲜培养斜面培养物上，液面高于斜面顶部1 cm左右，使菌体与空气隔绝。b)保存：注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（ 46）干燥处保存，需室温保存的菌种在室温（25）下保存。6.2.3保存周期保存时间为2-10年。保存期间应定期检查，当液体石蜡减少露出培养基斜面时，应及时补充灭菌的液体石蜡。如发现异常应重新培养后补上空缺。6.3冷冻干燥保存法适用范围6.3.1本方法适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次氏体、部分丝状真菌和酵母菌等的保存。6.3.2操作步骤冷冻干燥保存法操作步骤如下：a)菌种准备：在所保存菌种的最适培养条件下将细胞采

8、用斜面培养、液体培养等方式培养至稳定期或成熟期，进行纯度检查后与保护剂混合均匀，分装。b)分装：分装菌液应在无菌条件下操作。采用较长的滴管，直接将菌液滴入安瓿管或冻存管底部，每管分装量约 0.1 mL0.2 mL。若是球形安瓿管，装量为半个球部。分装后用脱脂棉堵住安瓿管管口，注意不要过紧或过松。分装时间尽量要短，最好在1 h2 h内分装完毕并预冻。c)预冻：一般预冻2 h以上，温度达到-40左右。3 DB 4117/T 3202021d)e)冷冻干燥：将预冻后的样品安瓿瓶迅速置于已充分预冷的冷冻干燥机样品舱内按照程序冷冻干燥。完毕后取出样品管置于干燥器内，备用。冷冻干燥时间一般为8 h20 h

9、。安瓿管封口及真空检验：从干燥器中取出冷冻干燥完全的安瓿管，在距管口5 cm左右用喷射火焰将管拉细后将管口连接到与真空安瓿管泵相连的橡皮管上，打开真空泵，在真空下用喷射火焰对准管细颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪检验真空度。保存：封口完全的冷冻干燥管保存于410。f)6.3.3保存周期一般在10年左右。6.4瓷珠保存法6.4.1适用范围适用于大多数微生物，如噬菌体、放线菌、丝状真菌、霉菌等的保存。6.4.2操作步骤瓷珠保存法操作步骤如下：a)b)将直径为2 mm3 mm的瓷珠分装到小螺帽瓶中制成冷冻管，高压灭菌。在无菌状态下打开冷冻管，在所保存菌种的最适培养条件下降细胞培

10、养至稳定期或成熟期，进行纯度检查后，将菌种新鲜培养物加入到培养基中制成混悬液，无菌操作将混悬液转入到冷冻管中。c)d)封好冷冻管颠倒四至五次乳化菌种培养基混悬液。切勿涡旋振荡。菌种吸附于瓷珠上后，将多余的混悬液吸出；如使用商业化的细胞冻存管，此时应按照产品说明书进行操作。e)保存：将冷冻管存于-70。6.4.3保存周期可保存10年。7菌种活化7.1标准菌种活化将标准菌种按说明书要求转种于适当的培养基内，于适当温度下培养适当时间，进行复苏。宜将标准菌种悬浮于营养肉汤中进行复苏。7.2保存菌种活化7.2.17.2.2定期移植法保存菌种取样后直接接种于固体培养基或适量的液体培养基中进行活化。液体石蜡法保存菌种恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜培养基上，生长繁殖获得第 1代菌种后，挑取单菌落再重新转接一次。7.2.3冷冻干燥法保存的菌种复苏先用70%酒精棉擦拭管的上部，用玻璃刀划开管顶端，用灭菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基，进行培养。4 DB 4117/T 32020217.2.4瓷珠保存法保存菌株在无菌条件下打开冷冻管，用无菌针或接种环取出一粒瓷珠。封好冷冻管并尽快将其送回低温条件下保存。将瓷珠直接接种于固体培养基或适量的液体培养基中。8记录8.1微生物菌种保藏和使