上课用2.1微生物的实验室培养课件

1、微生物的实验室培养了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。 一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法、稀释涂布法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：一、基础知识：（一）培养基 1.培养基种类及用途培养基是由人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供微生物生长繁殖的营养基质。按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分离

2、、鉴定、活菌计数及菌种保藏 观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定 大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究 液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长液体培养基固体培养基：微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏菌落菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。细菌的菌落特征因种而异 菌落：霉菌的菌落特征因种而异无动力 有动力(弥散)(是否运动) 半固体培养基：观察微生物的运动特征、分类鉴定按用途不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏

3、蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞选择培养基（耐高

4、浓度食盐的金黄色葡萄球菌）大肠杆菌呈 黑色中心 ,有金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征深紫色，并带有金属光泽 鉴别培养基：鉴定所培养生物的类型按成分不同划分天然培养基合成培养基化学成分不恒定的天然有机物牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁琼脂培养基。用于工业生产化学成分完全了解的物质配制而成的培养基高氏1号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定分类根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 合成培养基:天然培养基有血

5、清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的 分析;易发生支原体污染;天然培养基：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子； 激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多菌种分离,鉴定,计数半固体培养基加入琼脂较少菌种保存液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成分配制而成，培

6、养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生产，降低成本目的用途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药剂菌种的鉴别选择培养基添加（或缺少）某种化学成分菌种的分离2、培养基配制原则：（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。 细菌pH为：6.5-7.5； 放线菌pH为：7.5-8.5； 真菌pH为：5.0-6.0。3、培养基的营养构成不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足

7、微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素) 碳源、氮源、生长因子的比较来 源常用原料功 能碳源CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养生物的主要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、核酸、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等的组成成分。参与酶促反应细菌的营养类型 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养菌（autotroph

8、）异养菌（heterotroph）腐生菌、 寄生菌（大部分病原菌） 获得纯净培养物的关键是什么？不是。比如病毒只能寄生在活细胞内，目前常用于培养动物病毒的是活鸡胚。 所有微生物都可以用培养基进行培养吗？防止外来杂菌的入侵。无菌技术（二）无菌技术1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。 无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 （二） 无菌技术

9、避免杂菌污染的四个方面：01实验操作的空间、操作者的衣着和手超净工作台清洁消毒 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功培养微生物的关键。 02微生物培养的器皿、接种用具和培养基等灭菌接种环接种针涂布器03实验操作应在酒精灯火焰附近进行04避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。某种细菌的芽孢毛霉的孢子休眠体繁殖体芽孢 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3

10、小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。消毒煮沸消毒法在100，煮沸56min巴氏消毒法7075煮30min或80煮15min化学药剂消毒法紫外线消毒法灭菌指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灼烧灭菌接种工具（接种环、接种针或其他金属工具）160170加热1-2h干热灭菌玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等高压蒸汽灭菌100kPa,温度为121，维持1530min培养皿及容器的灭菌1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化学药剂消

11、毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒; 氯气消毒水源4、紫外线消毒：P16附录五(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌2、干热灭菌： 160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌： 100kPa、121 下维持 15-30min.(2)灭菌的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可

12、让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。 而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 消毒灭菌概念指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灼烧消毒法、干热灭菌、高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿，培养基等微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存1.无菌技术除了用来防

13、止实验室的培养物被其他外来微生物污染外， 还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择 合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考3、为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?营养成分不被破坏（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）二、实验操作1计算、称量2溶化3调pH：pH7.64过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积

14、的一半为宜。6加塞7包扎8灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸， 再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌 1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160 170 下灭菌2h。9倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作 见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10无菌检查： 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌 是否彻底。倒平板技术3.倒平板操作右手火焰大于瓶口的缝隙倒过来右手火焰大大于瓶口的缝隙倒过来培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0 g 源、 源、磷酸

15、盐和维生素蛋白胨10.0 g 源、 源和维生素NaCl 5.0 g_琼脂20.0 g/蒸馏水定容至1 000 mL氢元素、氧元素1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养碳氮碳氮基础梳理 夯实教材基础无机盐2.制备步骤计算依据牛肉膏蛋白胨培养基 的比例，计算配制100 mL的培养基时，各种成分的_称量可用称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要 ，称后及时 瓶盖溶化牛肉膏和称量纸水 取出称量纸加 和 加 至完全熔化(注意：不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂)补加蒸馏水至_配方用量迅速盖上蛋白胨氯化钠琼脂100 mL灭菌培养基用 法灭菌(压力100 kPa、温度121 、时

16、间1530 min)；培养皿用 法灭菌(温度160170 ，时间2 h)倒平板待培养基冷却至 左右时，在 附近倒平板高压蒸汽灭菌干热灭菌50酒精灯火焰制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒， 即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中，减少误差。制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒， 即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒加琼脂的目的是什么?作为凝固剂制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒， 即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧

17、盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞， 在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中 杂菌污染的作用。制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒， 即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能，因为培养皿要保持干燥，应该用 干热灭菌。1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板原因？你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平

18、板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位， 这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。5.怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？提示未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培

19、养基制备成功、合格，未受到污染。（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法1.平板划线法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后,可以分离到单个菌落。微生物的接种技术平板划线法操作：火焰接种环烧红火焰旁火焰已冷却的接种环一条缝隙迅速伸入平板划破一末二最后一区的划线倒置1 1.线条不重叠 2 2-3.从上次的末端开始，交叉23条线3 4 4.最后的划线不能与第一区相连。（3）平板划线法注意事项接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。划线首尾不能相接。划线后，培养皿倒置培养1224h。微生物的恒温培养微生

20、物的恒温培养微生物的恒温培养平板划线操作中三种灼烧的目的不同特别提醒项目目的沾取菌液前灼烧避免接种环上可能存在的微生物污染菌种每次划线前灼烧杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端划线操作结束后灼烧及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线

21、的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题讨论2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端 开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。问题讨论2. 稀释涂布平板法原理：将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行

22、培养。操作：在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成 ，从而能在培养基表面形成单个菌落。梯度稀释单个细胞A.系列稀释操作a.编号为101106试管中分别盛有9 mL水。b.用移液管吸取 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。1提醒：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。微量 移液器B.涂布平板操作涂布器消毒：将涂布器浸在盛有 的烧杯中取菌液：取少量菌液(不超过0.1 mL)，滴加到 表面涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后， 810

23、 s涂布平板：用涂布器将 均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动 培养皿，使菌液分布均匀酒精培养基冷却菌液提醒：取出涂布器时，应避免酒精滴落；燃烧后的涂布器，应冷却后再浸入酒精。稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个涂布蒸馏水作空白对照滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍关键点拨两种接种方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法用途一般用于菌种的纯化一般用于筛选菌株优点可对混合菌进行分离可以计数缺点不能计数操作复杂，若平板不干燥，则效果不好；若菌液浓度大，则长不出单菌落培养结果 1. 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列

24、稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论2.平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？提示(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。(2)划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。(3)接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划线后及时盖上皿盖。3.在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？4.稀释涂布平板操作结束后，为什么要将一个未

25、接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？提示划线末端含有的细菌数目较少，每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。提示培养未接种培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。(1)培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的 制备是成功的，否则需要重新制备。(2)接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落

26、的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌 菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌 落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。(3)是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的 同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要 是培养学生良好的科学态度与习惯。三、课题成果评价 1、临时保藏法 对象： 温度： 缺点：2、甘油管藏法： 对象： 温度：频繁使用的菌种 4（冰箱） 容易被污染或产生变异 长期保存的菌种 -20（冷冻箱） 四、课题延伸甘油冷冻管藏（-20）固体培养基斜面保藏（-4） 临时保藏长期保存大肠杆菌分离后保存菌种保藏方法的比较项目临时保藏甘油管藏适用范围 的菌种 的菌种培养基 培养基 培养基保藏温度4 20 特点需不定期转移菌种；保存时间短；菌种易被污染或产生变异保存时间长；菌种安全性和稳定性高具体方法接种到 培养基上在合适的温度下培养长成菌落 冰箱中保藏甘油瓶中装入甘油后 将菌液转移至甘油瓶中混匀后冷冻箱中保存频繁使用长期保存固体斜面液体固体斜面4 灭菌本课题知识小结:【典例解析】例1关微生物营养物质的叙述中，正