常用作物遗传转化的组织培养基的配置

1、MS大量元素X20名称2L的量溶于1L的水4L的量溶于2L的水NH4NO3 （硝酸铵）33g66gKNO3（硝酸钾）38g76gMgSO4 7H2O（硫酸镁）7.4g14.8gKH2PO4（磷酸二氢钾）3.4g6.8gCaCl - 2H2O（氯化钙）8.8g17.6g备注氯化钙单溶，溶解后再与前四种混合液混匀，然后 定容。MS微量元素X200KI （碘化钾）0.166gH3BO3（硼酸）1.24gMnSO4 - H2O（硫酸锰）2.38gZnSO4 - 7H2O（硫酸锌）1.72gNa2MoO4 - 2H2O （钼酸钠）0.050gCuSO4 - 5H2O（硫酸铜）0.0050gCoCl2 -

2、 6H2O （氯化钻）0.0050g备注：溶于1000ml水。MS有机 X200烟酸0.1gB10.1gB60.1g甘氨酸（氨基乙酸）0.4g备注:溶于1000ml水。MS铁盐 X200硫酸亚铁1.112gNa2 EDTA1.492g- 备注：分别溶解后混匀，定容于200ml水。氢氧化钠的配置：称4g NaOH粉末放到蒸馏水中，溶解后再定容到100ml即可。改良 MS （MS）X20KNO3（硝酸钾）19gMgSO4 - 7H2O（硫酸镁）3.7gNH4NO3（硝酸铵）16.5gKH2PO4（磷酸二氢钾）3.4gCaCl2 2H2O（氯化钙）4.4g备注：溶于1000ml水。MS，有机（与MS

3、相同）X200烟酸0.1gB10.2gB60.1g甘氨酸0.4g备注：溶于1000ml水。N6大量 X20kno3 （硝酸钾）56.6g（NH4）2SO4（硫酸铵）9.26gMgSO4 7H2O（硫酸镁）3.7gKH2PO4 （磷酸二氢钾）8gCaCL 2H.0（氯化钙）3.32g备注：氯化钙单溶，溶解后再与前四种混合液混匀，然后定容1000ml。N6微量X200MnS04 H20（硫酸锰）0.666gZnSO4 7H20（硫酸锌）0.3gH3B03（硼酸）0.32gKI （碘化钾）0.16g溶于1000ml水。N6有机 与MS有机相同N6铁盐与MS铁盐相同W14大量X20KNO3 （硝酸钾）

4、40gNH4H2PO4（磷酸二氢铵）7.6gMgSO4 - 7H2O（硫酸镁）4gK2SO4 （硫酸钾）14gCaCL - 2HO2.8g备注：溶于1000ml水。（氯化钙单容）W14 微量 X200MnSO4 - H2O（硫酸锰）1.6gZnSO4 - 7H2O（硫酸锌）0.6gH3BO3 （硼酸）0.6gKI（碘化钾）0.1gCuSO - 5HO（硫酸铜）0.005gCoCL2 6H2O 氯化钻）0.005N2mOo4 - 2H2O（钼酸钠）0.001g备注：溶于1000ml水。W14铁盐与MS铁盐相同W14有机与MS有机相同接种小麦花药的程序准备工作；培养基、用灭过菌的一水配75%酒精，

5、棉花，95%,火柴，酒精灯，直镊， 托盘，烧杯或塑料盒，放烧过镊子的皿底，装75%酒精的瓶子，将超净工作台打开吹 15分钟，然后擦干净即可使用。把样品拿到准备间内去叶，注意尖上留一点小叶，避免酒精渗进去。把一天的量弄够， 上午做不完的用保鲜膜包好放入4。冰箱，下午再用。消毒：将去叶的样品拿到超净工作台上，先用75%的酒精棉擦2次放入托盘中，再用 酒精棉擦第3次后放入盒中或烧杯中准备接种。点着酒精灯：把皿底及镊子烧好备用，再把三角瓶皮筋拆下，拿到灯前用火烧一下封 口纸，再斜着拿瓶把纸打开，用火烧一下瓶口，然后把烧好的三角瓶尽量往超净工作 台里面放，避免污染。用75%酒精壶喷一下双手消毒，把样品外

6、衣剥掉露出长穗，面对有棱的一面，先用直 镊剥去外壳露出花药，每一个花苞有3个花药，将其用弯镊轻轻地夹起磕到三角瓶中， 每瓶3个穗子大概100个花药。接好后，将镊子及三角瓶瓶口和封口纸烧一下，把三角瓶斜着拿用封口纸盖好，系上 皮筋写上名称及日期，放在培养箱中暗培养。观察：15-20天开始观察，只要出了愈伤就赶快把它转到分化培养基上。愈伤越小越好。小麦花药诱导培养基(PH 5.8)W14大量 X2050 ml/LW14 微量 X10010 ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖100g/L2,4-D(1mg/ml)2mg/LKT(1mg/ml)0.5mg

7、/L琼脂(培养基稍微软点)4.5g/L备注：放在30C培养箱中暗培养。(15 20天左右出愈伤)小麦花药分化培养基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/LKT(1mg/ml)0.5mg/L琼脂5g/L备注：小麦花药壮苗培养基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑2 mg/L琼脂

8、5g/L备注：小麦幼穗消毒步骤：1、.用75%酒精快速冲洗几秒钟，主要清洗根部。2、再用75%酒精快速冲洗一下，然后捞出放到烧杯里。小麦幼穗诱导培养基(PH 5.8)MS大量X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐X 2005ml/L有机X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖40g/L2,4-D (1 mg/ml)2mg/LNAA (0.5mg/ml)0.125mg/LKT (1mg/ml)0.1mg/L琼脂5g备注：筛选时再加筛选剂。每年在加筛选剂之前先找老师确认一下，然 后再加。筛选剂：lys (赖氨酸)1ml/LBia (除草剂)200ul/L草甘膦100ul/l小麦幼胚

9、消毒步骤：用75%的酒精冲洗一下。再用次氯酸钠（1 ： 1）浸泡10分钟。最后用无菌水冲洗56遍。小麦幼胚诱导培养基（PH 5.8）MS大量 X205 0 ml/LMS微量X 2005 ml/L铁盐 X 2005 ml/L有机 X 2005 ml/L肌醇10 0 mg/L蔗糖3 0g/L2,4-D (1mg/ml)2mg/L琼脂5g/L基因枪转化用植物凝胶4g/L备注：筛选时再加筛选剂筛选剂：lys （赖氨酸）1ml/LBia （除草剂）200ul/L草甘膦100ul/l小麦幼胚、幼穗分化培养基（PH 5.8）MS大量X2050ml/LMS微量X2005ml/L铁盐X2005ml/L有机X20

10、05ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/L玉米素(1mg/ml)10mg/LIAA(1mg/ml)1mg/L琼脂5g/L备注：分化培养基筛选剂减半小麦幼胚、幼穗壮苗培养基（PH 5.8）MS大量 X2050ml/LMS 微量X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑2mg/L琼脂5g/L备注：玉米幼胚诱导培养基(PH 5.8)N6大量 X2050ML/lN6微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L水解酪蛋白500mg/LL-脯氨酸

11、700mg/L蔗糖30g/L2,4-D (1mg/ml)2mg/L琼脂5g/L(硝酸银)AgNO3(10mg/ml)10mg/L备注：筛选培养基=诱导培养基+筛选剂筛选剂：Bia200ul/L草甘膦100ul/L玉米幼胚分化培养基(PH 5.8)MS大量X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L水解酪蛋白500mg/LL-脯氨酸700mg/L蔗糖30g/LKT (1mg/ml)1.5mg/LAgNO3(10mg/ml)0.5mg/L琼脂5g/L备注：分化培养基筛选剂减半。玉米幼胚壮苗培养基(PH 5.8)1/2MS 大

12、量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L水解酪蛋白200mg/LL-脯氨酸700mg/L蔗糖50g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑(40mg/ml)2mg/L琼脂5g/L备注：小结一、配置玉米诱导、分化培养基时，注意AgNO3（硝酸银）有毒，添加时要小心。二、如果小麦和玉米要打基因枪，在配置其诱导培养基时，一定要用植物凝胶（加4g/L）。三、在配大量元素时注意有CaCl22H20（氯化钙），切记把它用一个容器单溶，等前几样 完全溶解后，再将溶好的氯化钙倒入其中混匀。四、在配置培养基时：一般情况下

13、，大量、微量、铁盐、有机的实加量X瓶子上的倍数=1000ml，即实 加量=1000ml ：瓶子上的倍数。激素的实加量=所给数：瓶子上的数。在配好培养基，将它加热前用NaOH（氢氧化钠）调PH值=6.0，一般情况下1L加8 滴即可，如不行再每升加12滴慢慢调，直到PH=6.0，实际加热后PH值=5.8 了。当培养基加热至冒热气时，再把称好的琼脂倒入其中混匀至开，然后分装，灭菌。加琼脂时要根据其质量和天气冷热程度添加，一般情况下花药加4.5g/L，其它加 5g/L即可。到了冬天每升加4.5g。1、穗子拿来后，暂时不接的放入4。冰箱(最多放6天)。2、要接的穗子用百分之百次 氯酸钠浸泡10-15分钟

14、，然后用无菌水冲洗56遍。3、接好的花药放在30C培养箱中 暗培养，培养30天，随时观察，发现愈伤赶快转出来，愈伤越小越好。水稻花药诱导培养基(PH 5.8)N6大量X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖50g/L2,4-D(1mg/ml)2mg/LNAA(0.5mg/ml)1.5mg/L琼脂4.5g/L备注：水稻花药放在30C培养箱中暗培养。15-20天左右出愈伤，最好每天观察一下， 防止愈伤长大，愈伤越小越好。水稻花药分化培养基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐

15、X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/LKT (1mg/ml)2mg/LNAA(0.5mg/ml)1mg/LIAA (1mg/ml)0.5mg/L琼脂5g/L备注：水稻花药壮苗培养基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑(40mg/ml)2 mg/L琼脂5g/L备注：接种黑麦草的程序准备工作：先把工作台打开吹1015分钟,，同时把培养基、75%的酒精、95%酒 精、酒精灯、火柴、长直镊、培养皿

16、、装75%的酒精瓶子（放镊子）、剥好的草籽、 灭过菌的三角瓶、封口膜全部准备好，然后用75%酒精擦23遍超净工作台，即可 操作。操作步骤；1、把草籽外皮剥掉（不用泡水）。2、把剥好的草籽放在50ml的三角瓶里在超净工作台上用75%的酒精浸泡23分钟。3、再用次氯酸钠浓度为（1 ： 1）浸泡45分钟，浸泡过程中再倒入另外一个灭过菌的 小三角瓶里，把瓶口烧一下，再经常摇一摇。4、最后用无菌水冲洗56遍，即可。黑麦草诱导培养基（PH 5.8）W14大量 X2050ml/LW14 微量 X10010ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖100g/L2,4-D

17、(1mg/ml)8mg/LNAA(0.5mg/ml)4mg/LKT(1mg/ml)0.1mg/L琼脂5g/L备注：黑麦草分化培养基（PH 5.8）MS大量X2050ml/LMS 微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/LNAA (0.5mg/ml)0.5mg/LKT(1mg/ml)0.5mg/L琼脂5g/L备注：黑麦草壮苗培养基（PH 5.8）MS大量X2050ml/LMS 微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA (0.5mg/ml)0.5mg/L多

18、效唑（40mg/ml）2mg/L琼脂5g/L备注：黑麦草幼穗诱导和小麦幼穗诱导培养基（PH 5.8）W14大量+W14微量+铁盐+有机+肌醇+糖100g/L+4mg/L2, 4-D+0.5mg/LKT+琼脂（黑麦 草）W14大量+W14微量+铁盐+有机+肌醇+糖100g/L+2mg/L2, 4-D+0.5mg/LKT+琼脂（小麦） 烟草转化：共培养：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L分化培养：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+Kan200mg/L+cef500mg/L生根：MS+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+cef200mg/L注意：Kan和cef不能高

19、压灭菌，灭完菌以后用手摸一摸装有培养基的三角瓶不烫手了， 然后再加。甘薯快繁（PH 5.8）MS 大量X2050ml/LMS 微量 X 2005ml/L铁盐 X 2005ml/L有机 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖40g/L琼脂5g/L备注：甘薯叶片再生（ph 5.8）MS + NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+琼脂 5g/L1 /2MS + NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+琼脂 5g/L1 /2MS + NAA0.5mg/L+Zt0.1mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+琼脂

20、 5g/L1 /2MS + NAA0.5mg/L+Zt0.5mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+琼脂 5g/LMS+NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+AgNO30.5mg/L+糖 30gL+琼脂 5g/L(1DMS+NAA0.5mg/L+KT0.3mg/L+AgNO30.5mg/L+糖 30g/L+琼脂 5g/LMS + NAA0.5mg/L + KT0.1mg/L + ABA0.5mg/L + 糖 30g/L+琼脂 5g/LMS+NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+ABA1mg/L+糖 30g/L+琼脂 5g/LMS+NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+ABA

21、2mg/L+糖 30g/L+琼脂 5g/LLB培养基(PH 7.0)胰蛋白豚10g酵母提取物5gNCL10备注：加水至一升。基本培养基（MS0）MS大量+MS微量+铁盐+有机+肌醇100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L诱导（去分化）培养基一筛选培养基一分化培养基一生根（壮苗）培养基III暗培养（长愈伤）原培养基加筛选剂见光（长苗）用NaOH（氢氧化钠）调PH值，PH值5.8。一般情况下一升加8滴即可。一升培养基可倒24皿（2包）。接花药用小三角瓶，一般情况下一升倒40瓶左右（25ml/瓶）0方盒子一升倒16盒左右。兰花：MS + 6BA2mg/l+NAA1mg/l其它：MS+GA32mg

22、/l08.4.14兰花：MS + 6BA0.5mg/l+NAA1mg/lP25页三、4.有机化合物母液主要是维生素和氨基酸类物质，必须单配，其浓度有每毫升含0.1、 1.0、10mg化合物。6.植物激素：每种激素必须单独配成母液，浓度为每毫升含0.1、0.5、10mg激素，用 时根据需要取用。由于多数激素难溶于水，它们的配法如下：IAA、IBA、GA3先溶于少量的95%酒精，再加水定容至一定浓度。NAA可溶于热水或少量95%酒精，再加水定容至一定浓度。2, 4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。KIN和BA先溶于少量1mol的HCl中，再加水定容至一定浓度。玉米素

23、先溶于少量95%酒精中，再加热水至一定浓度。激素浓度的表示法有两种，一种是ppm（或每升中毫克数），另一种是mol（M）.四、培养基的配置方法：混合培养基中的各种成分依次加；大量微量铁盐有机植物激素及其它附加 成分，最后用蒸馏水定容至所需配的培养基体积的一半。PH计或PH试纸测PH值，并用0.1mol的NaOH或HCl调制PH为5.8。分装：注意不要把培养基倒在瓶口上以防污染。灭菌：用高温高压灭菌，一般用1.1Kg/cm2或15磅/时2压力，在121C下灭菌1520分钟。五、常用消毒剂的使用和效果:消毒剂使用浓度（%）清除难度消毒时间（分）效果次氯酸钠2易530很好次氯酸钙910易530很好漂

24、白粉饱和溶液易530很好氯化汞0.11较难210最好酒精70 75易0.22好过氧化氢10 12最易515好漠水12易210很好硝酸银1较难530好抗菌素450mg/L中30 60较好漂白粉：低毒有效的消毒剂，密封贮藏，随用随配。酒精：7075%酒精，生长组织只需浸1030秒，常用表面灭菌的第一步。次氯酸钠：安替福民配置成含有210%的次氯酸钠，一般组织浸泡1030分钟。它分解出的氨气起杀菌作用，很容易清除，对植物无害。氯化汞：是一种重金属化合物，有剧毒。0.10.2%氯化汞是一种效果极好的杀菌剂。 一般浸泡312分钟，用无菌水反复冲洗，洗净残留的汞，否则对培养物会产生毒害 作用。对于难消毒的材料，如有茸毛的，粗糙不平的、地下部的。在消毒之前，一般 要先在70%的酒精中浸泡数秒或数十秒钟，或在消毒剂中加数滴土温，增强消毒剂的 效果。禾谷类：玉米：可从多种外植体诱发愈伤组织，但再生植株的能力是有限的。幼胚被最广泛地用 于发生有植株再生能力的愈伤组织。MS培养基用得最广泛。2, 4-D是诱发愈伤组织的唯 一激素，浓度为2.3uM到67.8Um.4.5uM2,4-D再加21.5uM NAA和0.24uM Zip可促进愈伤 组织的发生。当培养幼胚时，盾片必须保持朝上。如培养幼嫩种子时盾片要向下，这样形 成的愈伤组织最多。除去2, 4-D可以再生植株。