幽门螺杆菌分离培养和鉴定

1、幽门螺杆菌分离培养和鉴定1 .实验设备：CO2气瓶、N2气瓶、CO2气袋、N2气袋、厌氧培养瓶、负压泵、 通气管道（带阀门）、培养箱、生物安全柜、酒精灯、接种环、普通 天平、电子天平、高压锅、玻片、显微镜、香柏油、平皿、三角瓶（带 盖）、10ml吸管、1ml吸管、吸头、2001冻存管、细胞冻存管、普 通冰箱、低温冰箱（-80C）、液氮罐、无菌滤器、加样器、无菌注射 器、眼科镊（带弯头）2 .实验材料：牛脑心浸液或布氏肉汤、月示蛋白胨、胰胨、氯化钠、磷酸氢二 钠12鸟02/无水、琼脂粉、抗生素（万古霉素、多粘菌素、二性霉素） 羊血、葡萄糖（10%）、小牛血清、氢氧化钠（2M）、蒸馏水、甘油 淀粉

2、、pH试纸、革兰染液、快速尿素酶试纸、过氧化氢（3%）、氧 化酶试剂、。-环糊精、酵母提取物、重亚硫酸钠、蔗糖、淋球菌转运 培养基有关试剂的配制：（1）选择剂：万古霉素（10mg/l）、多粘菌素（2500。/1）、二性霉 素（10mg/1）,三甲氧苄氨嘧啶（TMP） （5mg/1）。称量溶解后，采用 抽滤除菌，按照每次配制200 ml培养基所需量（1ml）分装，-20C保存备用半年。（注意：二性霉素不易溶解，抽滤时多数被滤除）（2）Hp培养基（牛脑浸液）配方：牛脑浸液100ml、牛心浸液125 ml、月示蛋白胨5g、氯化钠2.5g、 磷酸氢二钠1.25g,加水至500ml （加水275ml）、

3、琼脂粉（1.5%） 7.5g。 加热溶化后调pH至7.6-7.8。以200ml分装，灭菌。血平板：200 ml上述培养基中加入10%葡萄糖10ml（5%）、抗 生素1ml（0.5%）、羊血10ml，混匀后倒入无菌平皿。注：羊血需要 量入，不能够随便加入，要保证加入的量，宁多勿少（重庆医科大学 加 7%）。（3）Hp牛脑浸液培养基：上述未加琼脂粉的液体培养基20 ml 加小牛血清2 ml （10%），10%的葡萄糖1 ml （5%）。一般不加抗生素， 如果加，按照0.5%加入。加淀粉0.1g（0.5%）。（4）布氏琼脂：月示蛋白胨10g、胰胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠12H2O26.3g （

4、无水2.5g）、酵母提取物2g、重亚硫酸钠0.1g、g环糊精2g，加水 1000ml。按照1.5%-2.0%加入琼脂粉，琼脂粉需要分开加，一般分装 到100-200ml时按量加入。加热溶化后，高压灭菌前调pH至7.7左 右。（经验：3000ml+2M NaOH 8ml）注意：培养基每次制备200ml或更少，用时，溶化琼脂，加入 一定量的葡萄糖、小牛血清或血液，加样用灭菌的吸管。扩增用培养 基（纯培养）不需要加入抗生素，临床标本分离用时必须加入抗生素。（5）运送培养基：重庆医科大学采用淋球菌的运送培养基（改 良stuart运送培养基）/将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养 基中送检/蔗糖10

5、g，经56C灭活的小牛血清10ml，布氏肉汤100ml （称取布氏肉汤粉剂2.8g，加蔗糖10g，加水90ml，高压灭菌，加小 牛血清10ml，无菌分装，4C保存备用，7天内有效）。（6）保存液：20%甘油+5%小牛血清+Hp液体培养基样本采集和接种：重庆医科大学（1）胃镜处理：不能够用太浓的戊二醛，消毒结束后活检钳要 反复用自来水冲洗，活检钳头部要用干纱布把水擦干，以防活检钳中 储存消毒水，否则阳性率很低。（2）标本取出后要防止污染，用无菌的镊子夹取后放入到淋球 菌转运培养基中（半固体培养基）。（3）标本采集前作快速尿素酶试验，+”以上者才取材，两个 以+者不用取材，分离阳性率低。（4）标本

6、送到实验室后在接种前。最好放得干一点，太湿的话 不容易成功。（5）标本用分区划线的方法划开。第三军医大学固体平板：1）临床标本分离程序：在胃镜室将胃粘膜放在平皿上，用无菌 镊压一下，防止掉落。不能够在胃镜室时间太长，否则会死亡。拿到 实验室后，用无菌的眼科镊（弯头）在平皿表面反复涂划一区（一区 划的面积不要太大，尤其是动物的胃标本，其中的杂菌太多），然后 用接种环用分区划线的方法将其在培养基表面分开。2）纯培养程序：将分离培养的可疑菌落或储存的菌种直接用连 续划线或分区划线接种即可。注意：如果是挑选的可疑菌落，最好一 个菌落划一小区，一块平板可以多划几个小区，将来经过鉴定可以选 出真正的Hp来

7、。3）液体培养：准备20ml的肉汤培养基，用无菌的吸管吸取2ml 加入到固体平板纯培养物中，用L棒反复推洗，将细菌洗下，吸取全 部菌液，加入到液体培养基中，注意：锥形瓶的盖子不能够拧得太紧， 有助于气体进入。设置微需氧条件。摇床培养24小时，振荡培养箱 的振荡速度80-130r/min，终止培养，观察液体的透亮度，吸取菌液， 革兰染色后观察形态，形态不典型者，转种Hp固体平板培养基，再 次分离培养（-20C保存可等一周），吸取液体培养产物501，加入 固体培养基中，用接种环划线散开。注意：液体培养只能用于增菌，对于标本中混合有杂菌的标本， 不能使用。5.Hp的培养：（1）微需氧条件（5%氧气、

8、85%氮气、10%二氧化碳）建立： 采用抽气换气法。将培养基放入厌氧培养罐，拧紧螺丝，首先用负压 泵抽气至表-0.06的位置，（不能够完全抽空，目的是留5%的氧气）， 关上抽气阀，打开氮气控制阀至-0.01，随后关上氮气阀，打开二氧化 碳气阀，充气至0，随后关上厌氧罐的阀门。(2)湿度控制：在厌氧罐中放入一装水的青霉素瓶，打开瓶塞，保证湿度。(3)培养温度：35-37C, 3-5天观察结果。注意：培养瓶必须保证不漏气，进行全方位检测合格后方可充 气培养；每次观察结束后需要继续培养者必须重新充气；由于胃液 存在多种过路菌，一般原代培养不使用液体培养基；为提高阳性率 并防止污染，原代培养可应用非选

9、择性和选择性培养平板各1块； 条件好的实验室在接种3天后每天观察一次，条件差时，打开培养罐 次数过多可能增加污染机会。培养物：Hp的菌落为无色半透明，针尖大小，似露滴状。菌落数可能较 少(甚至每块板只有1个)，需仔细对光观察以免遗漏；L棒接种菌 量大时，菌落在培养板表面融合成一层半透明的菌苔。液体培养24 小时结束，固体平板版的纯培养2-3天结束，临床标本分离3-5天结 束。临床分离物中，由于存在较多杂菌，因此需要耐心的寻找“可疑 菌落即无色半透明，针尖大小，似露滴状”，随后转种血平板，转种 时可以多分区域，每个区域种几个可疑菌落，最后鉴定。临床分离株鉴定：首次从平板中分离出的可疑菌落往往很小

10、很少，直接鉴定 存在一定的困难，因此除非在有很多菌落的情况下，否则必须作纯培 养后继续鉴定。革兰染色：从临床标本分离的Hp形态往往很典型，呈细 长，弯曲，S型或海鸥展翅状，革兰染色阴性。此有重要鉴别价值！ 据此基本可以确诊。因为胃内很少有杂菌，更何况形态如此典型的杂 菌。（3）快速尿素酶试验：购置快速脲酶试纸（福建产品）将可以 菌落涂抹上去，很快显色者即为尿素酶试验阳性。（4）触酶试验：在玻片上滴加1滴3%过氧化氢，刮取可疑菌落 置入后，阳性者可见到连续的氧气泡形成。（5）氧化酶试验：取菌落少许，涂抹在氧化酶试纸上，变色者 为阳性。标本的贮存方法纯培养的Hp平板（48-72小时），加入2ml保存液，L棒推洗后， 吸取200p l至冻存管（200p l的Eppendof管），写好标签，放入低 温冰箱（-80C）。如果为液氮保存，冻存时要用细胞冻存管，防止冻 裂。如果为液体培养基，培养24小时后，离心浓缩细菌，收集沉淀 物，加入20%甘油，5%小牛血清即可保存。注意：细菌冻存时每一种细菌每次可以多