发酵工程第四章工业发酵灭菌与消毒课件

1、第四章工业发酵灭菌第一节灭菌的概念和必要性灭菌：是指用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌营养体和芽孢或孢子的方法。消毒：用物理或化学方法消除物料、容器、器皿内外的病原微生物的措施。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工程上灭菌：是指使用物理或化学方法将培养基中的杂菌的细胞和孢子杀灭至不影响发酵为限。灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。如有杂菌，可引起以下的后果：生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器中以杂菌为主。杂菌会污染最终产品。杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。杂菌降解所需要的产物。发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶

2、菌现象。发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备培养基灭菌设备灭菌好氧培养中空气灭菌培养过程中加入的物料要灭菌使用无污染的纯种设备严密，罐内保持正压工业上采取的措施1. 加热灭菌火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌2. 射线灭菌紫外线、阴极射线、X射线、射线3. 化学药剂灭菌0.%0.25%KMnO4溶液、0.5%1%漂白粉溶液、75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、苯酚溶液、来苏尔4.臭氧灭菌5.过滤除菌第二节 灭菌的方法 项目方法本质优点缺点化学物质灭菌化学反应简单不适合培养基灭菌辐射灭菌紫外线与菌体核酸的光化学反应；其它射线使水分子产生自由基紫外线

3、应用广泛-射线不经济，不安全干热灭菌加速与温度有关的胞内反应湿热灭菌蒸汽释出潜热使蛋白变性经济快速适用范围广臭氧灭菌氧化作用安全高效过滤灭菌利用菌体物理性质可用于热敏物质2.灭菌方法：工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。湿热灭菌简便、有效、经济。一、工业上培养基灭菌1.培养基灭菌的目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。3.培养基灭菌的要求（1）达到要求的无菌程度；（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基 组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。灭菌温度的选择应考虑的因素主要有： a

4、.微生物的热致死温度，应高于该温度。通常以芽孢为准。 b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程 因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。4.培养基灭菌的操作（一）实验室种子培养基灭菌方法使用高压蒸汽灭菌锅 手提式灭菌锅。容量小。立式或卧式灭菌锅。容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。分批灭菌（实消）：将培养基置于反应器中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫分批灭菌。连续灭菌（连消）：将培养基在罐外连续进行加热、维持

5、和冷却然后进入到反应器的杀菌方法就是连续灭菌。（二）发酵培养基灭菌的操作（1）分批灭菌在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程 优点：设备投资少，操作简便，染菌机会少； 缺点：蒸汽耗用大，发酵设备的利用率较低。 实消的步骤：配料三路进汽直接升温 排汽打开 冒汽后几分钟关闭 1Kg/cm2，保温30分钟后降温 通无菌空气 保压。注意事项：经一段预热时间预热至90，使物料受热均匀，减少冷凝水量达到灭菌温度（120 ）时，开始计算维持时间（保温时间）。生产上采用30min采用快速冷却方式，减少营养成份的损失（1）连续灭菌培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭

6、菌,冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程.优点保留较多的营养质量容易放大，较易自动控制；糖受蒸汽的影响较少；缩短灭菌周期；在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；发酵罐利用率高，蒸汽负荷均匀。缺点设备比较复杂，投资较大。 前面提到培养基湿热灭菌的时间和温度之间的关系，但实际上灭菌时间和温度还受培养基的氢离子浓度、营养成分、杂菌浓度、泡沫等因素的影响。5.影响培养基灭菌的因素（1）pH 培养基的pH为8.0时，微生物耐热性好，pH6.0时氢离子容易渗透入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应使其死亡。所以pH低，湿热灭菌效果好。 （2）培养基成分 培养基中的油脂、糖类、蛋白质等有机化合物，会在细菌周围

7、形成一层薄膜，影响热的传导，增加了灭菌难度。 （3）培养基含菌量 不同成分的培养基其含菌量是不同的，天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多，因此灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适当提高灭菌温度和延长时间。（4）泡沫 泡沫中的空气能形成隔热层，而影响热量发挥杀菌作用。因此灭菌前可适当加些消泡剂。操作时需注意排汽速度，尽量不引发泡沫。（5）培养基中颗粒物质 培养基中有直径大于1mm的颗粒物质则明显影响灭菌效果。因此蒸汽很难渗透到颗粒内部，故称为“灭菌不透”。二、发酵设备灭菌发酵罐灭菌实罐灭菌时，与培养基一起灭菌连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌前进行空消

8、附属设备灭菌空气过滤器补料系统消沫剂系统空罐灭菌培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从徘气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。定义：空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，称为空罐灭菌。1杀菌锅内灭菌 固体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持2030min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维

9、持1520min；玻璃器皿及用具灭菌，压力0.098MPa 3060min。2种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过达到死角灭菌，灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。3空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174MPa灭菌2h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。附：培养基与设备、管道灭菌条件 4种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80，再从取样管

10、、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121，维持30min。谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110，维持10min。5发酵培养基实罐实菌 从夹层或盘管进入蒸汽，间接加热至90，关闭夹层蒸汽，从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至121，维持30min。谷氨酸发酵培养基实罐灭菌为105，维持5min。6发酵培养基连续灭菌 一般培养基为130，维持5min，谷氨酸发酵培养基为11568min。7消泡剂灭菌 直接加热至121，维持30min。8补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉料液为121，维持5min。9尿素溶液灭菌 105，维持5min。 三、空气除菌空

11、气灭菌的方法加热空气：压缩空气的方法适用于无菌程度要求不高的发酵过程静电除菌 机制：空气在高压直流电场中电离，产生的离子使灰尘和微生物带电，被捕集于电极上优点：能耗低；空气压力损失小；除尘效率高缺点：高压技术，；设备庞大介质过滤除菌滤材要求：能耐受高温高压不易被油水污染除菌效率高阻力小成本低易更换一般介质深度过滤介质滤器形式纤维介质过滤器、粉末烧结金属过滤器、薄膜空气过滤器介质过滤器除菌的机制重力沉降：可以忽略惯性冲击：空气流速大时，起主导作用 拦截：空气流速小时，起主导作用 扩散：布朗运动4. 空气过滤除菌流程 （1）空气除菌流程的要求 空气应具有一定的压力，过滤器要高效，设备尽量采用新技术

12、，流程尽可能简化，降低动力消耗，工人操作简便，运转费用低。设备中要用无油润滑，否则有油雾，影响过滤效率。（2）流程分析空压机冷却分油水总过滤器分过滤器 1、高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到3035，第二级冷却至2025，经分水后加热到3035，因为温度升高，相对湿度下降。 2、冷热空气直接混合式空气除菌流程 特点 ：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为3035，相对湿度为5060%。 3、高效前置过滤除菌流程在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多次过滤），达到空气除菌的要求。 冻干基因工程1b干扰素制造及检定规程 （发酵部分）1） 每次发酵前必须进行一次空罐灭菌。2 ）发酵用GMD培养基，用蒸馏