流式细胞术（flowcytometerFCM）在出血与血栓性疾病中的应用

1、流式细胞术（flow cytometer，FCM）在出血与血栓性疾病中的应用 FCM在出血与血栓性疾病中的应用 集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体为一体的新技术。 对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速、灵敏、多参数定量分析和分选技术。 开创了对单个BPC或亚群分析的新途径。 FCM分析BPC的主要项目血小板计数：CD41、CD61射门网织血小板（RNA噻唑橙黄染料）：含RNA的BPC自身抗体:特异性血小板抗体、PAIg、同种抗体免疫表型分析：膜糖蛋白表达: GPIb/IX/V复合物(CD42a、CD42b、CD42c、CD42d) GPIIb/IIIa复合

2、物（CD41、CD61）FV、IIIaBPC活化：膜糖蛋白表达（P-选择素，CD62p） BPC内物质，微粒对不同刺激剂的反应性：胞质钙流 FCM在出血性疾病中的应用1、血小板减少：血小板数量、网织血小板 2、血小板功能缺陷 血小板无力症： GPIIb-IIIa（CD41- CD61） 巨大血小板综合征： GPIb-IX（CD42b-D42a3、血小板抗体： 血小板相关免疫球蛋白（PAIg） 血小板糖蛋白特异性自身抗体（GP）4 、血小板采集、储存与输注的监测.出血性疾病的分类 血管壁功能异常 遗传性（毛细血管扩张症、家族单纯性） 获得性（过敏性紫癜、血管炎、免疫性） 数量 遗传性、 获得性

3、Aa 、巨核、免疫性、 ITP、DIC 血小板异常 数量 （ET，CML） 功能异常（GT、BS、颗粒性） 凝血功能障碍 遗传性（血友病、 VWD、其他凝血因子缺乏） 获得性（VK缺乏，肝脏病，DIC、药物） 循环中病理性抗凝物质 凝血因子抑制物 肝素样抗凝物质；狼疮样抗凝物 纤维蛋白（原）溶解亢进 遗传（t-PA/u-PA抗纤溶酶） 获得（DIC，血栓症） 血小板计数BPC直径1-4m，与RBC，WBC或碎片、免疫复合物大小相等，影响计数准确性。 FCM优点： 利用各种BPC特异性单克隆抗体直接标记荧光素分子 快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差5% ， 尤其适合BPC20X109/L 重

4、复性好 缺点：技术条件要求高，费用高。 FCM分析血小板原理 利用荧光素标记的BPC特异性单抗或与待测成分特异性结合且能发荧光的物质 + 分离BPC或全血去除未反应的单抗或荧光物质; 特异检测5000-10000 BPC光散射与荧光信号（单色或多色）;获取, 统计数据, 分析,根据光散射与荧光强弱计算阳性BPC百分比或所测成分的含量（GP/BPC). FCM分析血小板方法 抗凝血2ul 调节BPC 105-106/ml 2-80C 预冷的1% 多聚甲醛1ml固定，2h BPC特异单抗+荧光剂(异硫氰酸荧光素)(CD42b FITC) +SSC+FSC设门-特异性选择BPC. 检测10000-1

5、00000 BPC表面荧光信号.FCM获取，分析数据 结果表示: 平均颗粒荧光强度-活化时GP:Ag量 特异性荧光抗体结合阳性BPC% -x. 血小板光散射图 FCM分析血小板的客观评价利用各种BPC特异性单克隆抗体直接标记荧光素分子优点：1、接近生理条件直接测定血小板:2、微量（2ul)3、快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差ELISA (单个BPC上PAIg) MAIPA（单抗特异性捕获血小板抗体试验） PAICA（ BPC相关IgG特异性试验）特异性 MAIPA PAICA 血小板抗体免疫流式检测法（PAICA) FCM检测PAIg在诊断ITP中的评价1、用于严重BPC减少者PAIgG

6、检测；2、特异性 2倍ITP+出血，提示PMP有止血功能。 PMPS：TTP、TIA、AMI、DM、APL、CPB (心肺旁路术)、ACS. PMPS：罕见、Scott综合征、PMP形成障碍。 PMP检测的临床意义1、肝素引起的血小板减少症（HIT）/HIT血栓 抗肝素抗体+PF4复合物+BPC FcrIIa BPC激活PMP血栓2、急性冠状综合征：活化BPC PMP 。3、糖尿病： PMP； DM+肾病PMP ，提示：检测DM并发症。4、PNH+血栓：补体损伤CD55/59 的BPC对凝血酶激活敏感 BPC活化 PMP FCM在血栓性疾病应用总结1、血栓前（高凝）状态：BPC“活化”是参与血栓的前提，BPC活化指标： TXB2、GP（IIb/IIIa、Ib、V）、-TG、PF4、 GMP-140；2、冠心病：P-sel；CD41/CD61；sGC均 不稳定心绞痛： P-sel，GPV AMI：P-sel，GPV ； 溶栓再通：1