线粒体疾病分子生物学检验

1、线粒体疾病分子生物学检验线粒体（Mitochondrion）1. 真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2. 多数细胞含几个到几千个线粒体3. 每个线粒体含2-10 线粒体DNA（mtDNA）2线粒体功能Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634648 ATP能量代谢3其他功能 储存钙离子 调节膜电位并控制细胞程序性死亡 细胞增殖与细胞代谢的调控 合成胆固醇及某些血红素 产热 Wikipedia线粒体病 Mitochondrial disorders发现- 1962 年， Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同

2、时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年， Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA 突变可引起人类疾病。 定义- 是遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率- 约为1:5000（约每5000人中1人发病）Smeitink 2006线粒体病 mitochondrial disorders 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病线粒体蛋白16,569 bp circular double stranded (mtDNA) 20%1,500 nuclear genes 80

3、% structural protein of the OXPHOS complexes protein required for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins involved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fissionDouglas C. Wallace, 18171819Shoubridge, 2001; Schapira，2000进一步导致线粒体功能异常：底物

4、的运输缺陷；底物的利用缺陷；柠檬酸循环异常；氧化磷酸化脱偶联；呼吸链异常。发病特点 核基因突变常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传 线粒体基因突变母系遗传 （突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。遗传异质性婴幼儿起病较常见 编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征 线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRP

5、S16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症， 该女婴在出生后3天死亡。核基因突变线粒体基因突变 突变的影响： 引起呼吸链功能缺陷 氧化磷酸化酶异常 阈值效应：组织特异性 突变的 mtDNA 在复制分离时可能不均等分配 母系遗传：不同突变后代发病风险不同。 相比A8344G突变，携带 A3243G 突变的母系后代更容易发病。 突变分布：同质性各器官组织分布相同 异质性不同组织、细胞分布不同 一般特点母系遗传 （Maternal Inheritance）11同质性突变与异质性突变12线粒体基因同质性（Homoplasmy）0 或 100%异质性（Heter

6、oplasmy） 0-100%核基因纯合子（Homozygous） 0 或 100%杂合子（Heterozygous）50%mtDNA同质性/异质性突变与阈值13线粒体基因突变点突变 目前已报道的mtDNA 点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种 LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排 重排突变逾数百 遗传性痉挛性截瘫等 )线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂常染色体隐性遗传（Autosomal Recessive）

7、常染色体显性遗传（Autosomal Dominant）性连锁遗传（Sex linked）母系遗传（Maternally inherited）临床表型复杂累及多系统（Multisystemic involvement）影响几乎所有组织器官（Any organ or tissue can be affected） 15线粒体功能涉及众多的组织器官16线粒体病的共同临床特点 婴儿期发病： 常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。 儿童发病： 见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。 中枢神经系统损害： 共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等 周围神

8、经损害： 交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征 视听神经损害： 视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失出现在KSS 肌肉病 见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinnery et al. Lancet 2000线粒体疾病的生化诊断当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等）血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；乳酸/丙酮酸比高(50:1)提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病。酶测定 氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定。（western、比色法

9、等）方法不稳定 一般情况下，血清CK（肌酸激酶）正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失时非常高。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292线粒体疾病的生化诊断当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点：（1）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或破碎红纤维（ RRF ）为主要病理改变。（2）上述病理改变出现的频率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改变。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-29219儿童及成人线粒体疾病的诊断标准A

10、符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系统不明原因发病 必须至少三个系统出现临床症状 除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能 排除其它代谢和非代谢疾病B 肌活检在骨骼肌中存在2%破碎样红肌纤维主要诊断标准(Bernier et al, 2002)(3, 5)C 有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现： 50岁以下肌活检COX阴性肌纤维2%； 50岁以上肌活检COX阴性肌纤维5%； 任一组织中呼吸链酶活性20%； 任一细胞系中呼吸链酶活性30%； 多于两组织内相同呼吸链酶活性30%；主要诊断标准21次要诊断标准：A 症状符合线粒体脑肌病的

11、临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：3050岁肌活检RRF在1%2%；30 岁以下肌活检出现RRF；电镜下见广泛线粒体异常；B 至少一种呼吸链功能受抑制的表现：生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%30%；用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；(Bernier et al, 2002)(3, 5)次要诊断标准：C 发现可能相关的mtDNA 异常；D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现：脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；若疑为KSS，脑脊液蛋白质增高；PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低；最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。(Bernier et al, 2002)(

12、3, 5) 符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要诊断指标的即为确诊线粒体病； 符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要诊断指标的为拟诊线粒体病； 符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292线粒体病诊断时应注意 基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合 要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变 线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系 散发与遗传的相关性 ，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素第一节

13、 线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病26 人类线粒体基因组Light strand: 8 tRNA and 1 mRNA (ND6)Heavy strand: 14 tRNA, 2 rRNA, and 12 mRNAPolycistronic with posttranscriptional processing 基因组小, 仅16569 bp 双链环状DNA 13 结构基因 / mRNA 22 tRNA 基因 2 rRNA 基因 12S rRNA 基因 16S rRNA 基因 非编码区 D-loop（约1120bp） L链复制

14、起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys） 高突变率线粒体基因组及其表达系统27 The two strands of mtDNA are differentiated by their nucleotide content with the guanine rich strand referred to as the heavy strand, and the cytosine rich strand referred to as the light strand. The heavy strand encodes 28 genes, and the light strand

15、encodes 9 genes for a total of 37 genes. Of the 37 genes, 13 are for proteins (polypeptides), 22 are for transfer RNA (tRNA) and two are for the small and large subunits of ribosomal RNA (rRNA). CategoryGenesNADH dehydrogenase(complex I)MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6Coenzyme

16、 Q - cytochrome c reductase/Cytochrome b(complex III)MT-CYBcytochrome c oxidase(complex IV)MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3ATP synthaseMT-ATP6, MT-ATP8Transport chain (13 peptides)Many of the genes encode the transport chain:2 rRNAsMitochondrial rRNA is encoded by MT-RNR1 (12S rRNA) MT-RNR2 (16S rRNA).22 tRNA

17、sThe following genes encode tRNA:Amino Acid 3-Letter 1-Letter MT DNA AlanineAlaAMT-TAArginineArgRMT-TRAsparagineAsnNMT-TNAspartic acidAspDMT-TDCysteineCysCMT-TCGlutamic acidGluEMT-TEGlutamineGlnQMT-TQGlycineGlyGMT-TGHistidineHisHMT-THIsoleucineIleIMT-TILeucineLeuLMT-TL1, MT-TL2LysineLysKMT-TKMethion

18、ineMetMMT-TMPhenylalaninePheFMT-TFProlineProPMT-TPSerineSerSMT-TS1, MT-TS2ThreonineThrTMT-TTTryptophanTrpWMT-TWTyrosineTyrYMT-TYValineValVMT-TVHV2HV1340731636516024Control regionD-loop576Replication Human mitochondrial DNA (mtDNA) has three promoters, H1, H2, and L (heavy strand 1, heavy strand 2, a

19、nd light strand promoters). The H1 promoter transcribes the entire heavy strand and The L promoter transcribes the entire light strand. The H2 promoter causes the transcription of the two mitochondrial rRNA molecules. Transcription The process of transcription initiation in mitochondria involves thr

20、ee types of proteins: the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), 2. mitochondrial transcription factor A (TFAM), 3. mitochondrial transcription factors B1 and B2 (TFB1M, TFB2M). condonAnti-condonNuclear tRNAMt-tRNAGCUGCCGCAGCGGGCUGCUGC第一节 线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病43核基因组与线粒体基

21、因组的相互作用核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了13条多肽链“交叉对话（cross-talk）”机制44第一节 线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异碱基突变：点突变。其中结构基因的点突变，与核基因组一样，包括同义突变和错义突变缺失与插入：mtDNA拷贝数目突变：线粒体基因组变异与疾病耳聋，Leber遗传性视神经病变，糖尿病，高血压，肿瘤45在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(U

22、UR)基因）MERRF（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）： A8344G (80%), T8356C（在tRNALys基因）Leber视神经病（LHON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）耳聋（Deafness）: A1555G, T1494C（在12S rRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿病（Type 2 Diabetes）: A3243G（在tRNALeu(UUR)基因） NARP（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：T8993G, T8993C（在ATPase 6 基因）46线粒体病的分子诊断标本选择： 外周血白细胞最常用 毛发 唾液

23、 尿液 骨骼肌检测 mtDNA分子诊断的最好标本 检测已知DNA突变的方法： 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO） 等位基因特异性扩增（ASA） 限制性片段长度多态性分析（PCR-RLFP） 连接酶链反应（LCR） 基因芯片技术 检测未知DNA突变的方法： 单链构象多态性（PCR-SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DEEG） 异源双链分析（HA） DNA序列测序 变性高效液相色谱（DHPLC）分子诊断方法线粒体疾病中常见的突变核基因突变（nuclear gene mutations）氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质, 例如: Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.呼吸链

24、缺陷: 重复、缺失线粒体DNA点突变（mtDNA point mutations）LHON, MELAS, MERRF, NARP, etc.mtDNA缺失/重复（mtDNA Deletions/duplications） eg. KSS, Pearson synd, diabetes & deafness未知遗传（unknown inheritance）49第二节 线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测50“千手观音” 21位聋哑演员中 18人有药物史部分患者使用正常剂量也会致聋“一针致聋”现象突变位点基 因同质性/异质性疾 病首次报道aT961delT+

25、C(n)ins961insC12S rRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Thyagarajan et al. (2000)C1494T12S rRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal异质性综合征型耳聋Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)异质性综合征

26、型耳聋van den Ouweland, et al.(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Nakamura et al. (19

27、95)A8344GtRNALys异质性综合征型耳聋Shoffner et al. (1990)G8363AtRNALys异质性综合征型耳聋Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同质性综合征型耳聋Rigoli et al.(2001)G15927AtRNAThr同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Wang et al.(2008)第二节 线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术检测位点引物序列(53)退火温度() 产物长度(bp)A1555GC1494TCGA TCA

28、ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT53对1642 例氨基糖苷类诱发的非功能性耳聋汉族聋儿进行线粒体 12S rRNA 变异检测J. Lu et al. / Mitochondrion.2010,10(4):380390545512S rRNA 基因中有 68 个核苷酸变异所有的核苷酸变异均为同质性68 个核苷酸变异中，有 3 个 C1494T 其余 65 个变异为 A1555G565758第三节 线粒体与L

29、eber遗传性视神经病变与 Leber 遗传性视神经病变相关的 mtDNA 突变Leber 遗传性视神经病变相关的 mtDNA 突变常用检测技术59Lebers Hereditary Optic Neuropathy (LHON)LebersHereditary inherited from mitochondrial DNAOptic affects the eyeNeuropathy disease/abnormality of nervous systemDegeneration of retinal ganglion cells and their axonsInherited fro

30、m maternal mitochondrial DNAOccurs during young adulthoodAcute Phase:Painless, acute onset of central vision lossLoss of visual acuity/colouronce symptoms appear in one eye, other eye affected weeks laterSub acute Phase atrophy of optic disc legally blindAsymptomatic until visual blurring developsSi

31、gns and SymptomsMaternal inheritanceMutation occurs in mitochondrial DNA (mtDNA)Only the egg contributes mtDNA to the embryoGenetics of LHON(1) G11778A: 50-60% LHON population(2) G3460A: 8-25% LHON population(3) T14484C: 10% LHON populationSingle Point Mutations3 major pathogenic mutations:G14459A T

32、14484CMales vs. FemalesLHON is predominant in malesStudies looking at x-linkage have not been confirmed nor statistically significantEpidemiology race dependent1177834601448470% Europeans90% Asians86% Quebec CanadiansDue to Founder Effect （奠基者效应）Koreanspresence of mixture of more than one type of or

33、ganellar genome ie mtDNANumerous cell divisions and thus lots of time is required for mutant alleles to be expressed in mitochondriaSymptoms dont appear until adulthoodAlso implicated as the reason for variability in severity of vision lossHeteroplasmyPhotoreceptorsInterneuronsRGC (retinal ganglial

34、cells)Neurons Axons make up optic nerve RetinaFire action potentialsHuge ATP demandVery sensitive to energy supply and mitochondria defectsEspecially RGCs for central visual fieldLimited regeneration abilitiesRGC: neuronsOther neurons in the body can be affected too (CNS + PNS)This results in Lebers

35、 Plus Movement disordersTremorsCardiac conduction defectsMS-like（多发性硬化样） featuresAll Neurons are VulnerableATP DemandLeberOxidative Phosphorylatione- Transport ChainROSReactive O2 SpeciesOxidative stressRGCComplex 1 e- prematurely leak to O2 aka. NADH DehydrogenaseMitochondrial MatrixIntermembrane S

36、pace3 point mutations4e- + 4H+ + O2 2H2Oe- + O2 O2-Less ATPLeberATP DemandOxidative Phosphorylatione- transport chainROSReactive O2 SpeciesOxidative stressMore SuperoxideO2-RGCLeber: oxidative stress + ATP deprivation Atrophy: wearing away of tissue Chronic oxidative stress: Apoptosis (cell death)Th

37、ings go wrongThe link is important!Genetic Testing for the maternally inherited mitochondrial DNA. Avoid potential environmental precipitants such as tobacco and excessive alcohol.Avoid medications which have been shown to induce the disease (Ethambutol乙胺丁醇, Chloramphenicol氯霉素) Vision damage from de

38、generation of optic nerveMaternally inherited through mtDNA3 point mutationsComplex I ROS (reactive oxygen species)TreatmentAntioxidantsInhibit mitochondrial-dependent apoptosis突变位点基因同质性/异质性首次报道*G3316AND1同质性Saillard et al.(2000)T3394CND1同质性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同质性/异质性Huoponen et al.(1991)C3

39、497TND1同质性Kong et al.(2003）G3733AND1同质性/异质性Valentino et al.(2004)C4171AND1同质性/异质性Kim et al.(2002)T4216CND1同质性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同质性Herrnstadt et al.（2002）G7444ACO同质性Huoponen et al.（1993）T10663CND同质性Brown et al.(1995)G11696AND4同质性/异质性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同质性/异质性Wallace et al.(198

40、8)T12338CND4同质性Wong et al.（2002）G14459AND6同质性/异质性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同质性/异质性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同质性/异质性Johns et al.(1992)A14495GND6异质性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同质性Ozawa et al.（1991）C14568TND6同质性Wissinger et al.(1997)A14693GtRNAGlu同质性/异质性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同质性Li et

41、al.（2006）原发性突变：G3460A， G11778A，T14484C的突变，占全部LHON的 80-90继发性突变：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257A新突变： A4435G 位于tRNAMet 基因可以调节ND4 G11778A 突变的外显率与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变79A4435G可以调节ND4 G11778A 突变的外显率tRNAMet80第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber病变相关的mtDNA突变常用检测技

42、术PCR-RFLP技术PCR-SSCP技术DHPLC技术DNA测序技术G3460A， G11778A，T11484C原发性突变测序图81第四节 线粒体与糖尿病线粒体糖尿病美国糖尿病协会(1997)/世界卫生组织(1999)制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的13据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为2.96%线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断82第四节 线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断83线粒体DNA突变与糖尿病突变位点累及基因同质性/异质性疾病首

43、次报道C1310T12S rRNA同质性糖尿病临床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同质性糖尿病临床表型Vawter et al.(2009)A3243G*tRNA Leu (UUR)异质性糖尿病合并耳聋Van den et al.(1992)C3254AtRNA Leu (UUR)异质性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)异质性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)异质性糖尿病Jaksch et al. (1995)G3316AMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿

44、病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同质性糖尿病合并耳聋Jaksch et al. (1995)A3399TMT-ND1同质性妊娠糖尿病Ng et al.(2000)T4291CtRNA Ile同质性糖尿病临床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同质性非胰岛素依赖性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同质性糖尿病合并耳聋Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同质性/

45、异质性糖尿病合并耳聋Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同质性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同质性糖尿病Onaya et al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)异质性糖尿病合并耳聋Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同质性/异质性糖尿病合并耳聋Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同质性2型糖尿病Poulton et al. (1998)84携带tRNA Leu(UUR) A3243G突变的糖尿病家系85399bp307bp92

46、bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 为异质性突变RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWT86携带tRNAGly T10003C突变的糖尿病家系 87tRNAGlyT10003C为同质性突变88AtRNAGly/tRNAstRNAThr/tRNAs89Secondary structure of tRNAGlySecondary structure of tRNALeu(UUR)9091第四节 线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断PCR技术正向引物（F）：5-TTCACAAAGCGCC

47、TTCCCCC-3反向引物（R）：5-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3 扩增片段398 bp（31533551bp）DHPLC技术PCR-RFLP技术DNA测序技术92分子诊断研究 （A3243G异质性分析）收集病人外周血抽提DNAPCR扩增目的片段 PCR-RFLP测序验证RT-ARMs-qPCR（amplificationrefractorymutation system）Pyrosequencing（焦磷酸测序） Targeted Next-Generation Sequencing 二代测序High-throughput sequencing实例母系遗传糖尿病家系注：母系

48、成员共24人，其中糖尿病患者为10人。相应PCR产物经普通测序验证：MIDD 母系遗传性糖尿病伴耳聋(maternally inherited diabetes and deafness):PCR-RFLP图 含mtDNA 3243 PCR产物的限制性内切酶（ApaI）酶切结果图mtDNA 3243 异质性突变检测结果M：DNA marker；Lane 1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17：mtDNA 3243 异质性突变；Lane 4、5、14、15：mtDNA 3243 未突变；限制酶Apa的酶切位点(GGGCCC), 由于该突变为异质性突变, 故应该会出现553、423、130 bp 共3 条条带; 而野生型没有Apa的酶切位点, 故电泳只能看到长度为553 bp的1 条片段引物可以覆盖整个线粒体DNA基因组（3组）PCR产物 富集过程基因组DNA文库高通量捕获测序 Targeted Next-Generation Sequencing探针应用技术平台 Illumina GAllX 作为新一代分子生物学综合技术平台，G