第四组液相色谱法测定对位红

1、液相色谱法测定对位红第四组：李阳 吴凯 王雨婷 葛钰蓉1 目前对于食品中的对位红测定方法主要采用薄层色谱法“液相色谱分析法”列和液相色谱质谱分析法等，其中法定检测方法包括欧盟委员会规定的辣椒粉中苏丹红测定的高效液相色谱法测定和我国质检总局颁布的食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法(GBT196812005)，但这两类标准检测方法中存在一定的技术缺陷，如样品本底干扰定性结论、固体萃取柱的活性难于控制、均未涉及对“对位红”的检测方法建立、对检测的干扰等。本方案针对标准实施过程中可能出现的复杂问题，探讨了在提取、分析方面的条件优化，使液相色谱质谱联用仪能满足日常的检测工作的需要。2一、对位红的简

2、介对位红亦称对硝苯胺红，常温下呈固态，密度1.50g/cm3,熔点248-252。是一种常用的红色颜料，属于重氮系列化工合成染色剂，主要应用于机油，蜡，油彩，汽油等工业产品。对位红的熔点即已达到250 ，明显不能采用气相色谱法来进行检验，因为样品很难汽化。所以我们采用液相色谱法来对其进行检测。3 物化性质1、物理性质： 对位红亦称对硝苯胺红，常温下呈固态，密度1.50g/cm3,熔点248-252。是一种常用的红色颜料，属于重氮系列化工合成染色剂，主要应用于机油，蜡，油彩，汽油等工业产品。2.化学性质 它和引发英国有史以来最大一起食品召回行动的“苏丹红”染料相似，都是工业上使用的化学物质，都被

3、禁止在食品染色剂中使用。据牛津大学物理与理论化学实验室的化学品安全信息介绍，“对位红”对眼睛、皮肤和呼吸系统有刺激性，但其毒性尚在研究中，没有明确的结论。4二、对位红检测及标准检测方法一、液相色谱法 1.高效液相色谱法 2.凝胶净化液相色谱法 3.反相高效液相色潽法二、分光光度法-紫外可见分光光度计5二、检测方法1、1 高效液相色谱法实验室操作方案仪器：天美液相色谱仪、超声清洗器、无油真空泵及溶剂过滤装置、滤膜过滤器、平头微量进样器试剂：乙腈（色谱纯）、冰醋酸。色谱条件： 色谱柱选用C18柱（柱长15cm）；柱温： 30；进样量： 20 L；样品运行时间： 15 min； VWD 波长选用48

4、5 nm，作为对位红的检测波长；流动相为乙腈:水/ 90:10，不需要缓冲6 步骤：（1）取乙腈400ml，用0.45um的有机滤膜过滤后置于原瓶。取16ml冰醋酸溶于100ml蒸馏水中，用0.45um的水相滤膜过滤后置于乙腈瓶中，贴上标签。超声波清洗器脱气15min。将配置好的流动相置于色谱仪旁的篮筐内，放入流动相吸液管。（2）准确称取1-（4-硝基苯基偶氮）-2-萘酚10mg，用经过滤及脱气后的乙腈定容至100ml，作为标准贮备液，浓度为100ug/ml。分别吸取该储备液0.10、0.20、0.40、0.80、1.00ml置于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即配成对位红浓度分别为0.

5、10、0.20、0.40、0.80、1.00ug/ml的标准溶液7（3）准确称取对位红样品10.0mg，用经过滤及脱气后的乙腈定容至100ml，从中取1ml再用乙腈稀释至100ml。（4）打开液相色谱仪电源开关，开高压输液泵开关。设定流动相A通道流量为100%，设流动相流速为1ml/min。（5）启动泵开关，打开紫外检测器电源开关。设定检测波长为480nm（6）打开液相色谱工作站，选择通道。（7）观察基线状态，当基线走直后，即可进样。（8）开始进样：平头微量注射器用乙腈清洗5次，废液排到滤纸上。将进样阀柄置于“load”位置。8（9）在注射器中吸入标样或试样60ul，注入进样口，重复3次，此时

6、对定量管进行了清洗。（10）吸入标样60ul。将标样注入进样口，顺时针旋动进样阀至“inject”位置。此时工作站开始自动计时。（11）数据采集：从计算机显示屏上可以看到样品的流出过程和分离状况，待所有的色谱峰流出完毕后，按“stop“键停止分析。记录保留时间及色谱峰面积。（12）结束工作：所有样品分析完毕后，让流动相继续流动1020min。关闭色谱工作站、关闭检测器电源、关闭液相色谱仪电源开关。9数据处理：（1）绘制工作曲线：以对位红标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制工作曲线（2）从曲线上直接查的未知试样对应的质量分数。数据处理：保留时间：4.521峰高：210123峰面积：2

7、21456101.2凝胶净化液相色谱法优点：操作简单，填充完凝胶柱后可重复使用，实际用量少于欧盟及国标方法，并且用淋洗液替代剧毒而又昂贵的乙腈进行提取，自制凝胶柱净化富集避免了欧盟方法用乙腈直接萃取进样对色谱柱寿命的影响及杂质峰的干扰，也避免了国标方法中采用氧化铝柱净化活度难以控制的麻烦，一次进样可同时检测食品中对位红、苏丹红的含量应用范围：食品及调味品中对位红、苏丹红的检测仪器及试剂：Agilent 1100 高效液相色谱仪(含二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器)层析柱 1. 6 cm 50 cm ,填充Bio2Beads S2X3凝胶。苏丹红、及对位红标准品,纯度均大于95 % ,配制时

8、用少量三氯甲烷溶解,乙腈定容为0. 500 0 g L - 1 储备液(按实际含量折算) ,使用时用乙腈稀释至所需浓度。11色谱条件色谱柱Zorbax SB2C18 ( 4. 6 mm 250 mm ,5m) ;流动相:乙腈(A) + 酸性水溶液(用乙酸调至约p H 4. 0) ; 洗脱程序: 0 9 min A 90 %; 9 12 min ;A 线性变化到100 % ,保持5 min 后回到初始比例;流速1. 0 mL min - 1 ;柱温35 ;进样量20L ;二极管陈列检测器,程序可变波长见表1 。121.3反相高效液相色潽法简介：在推荐参考方法的基础上,对分离和色谱条件加以改进、优

9、化、选择,用于几种含对位红食品采用拟定的方案进行分离检测。结果:方法的检出限为011g/ml,标准曲线的线性相关系数( r) 019999,在014-116g/ml添加水平间,加标的回收率95% 105% , RSD 019% 911%。改进的方法准确可靠,检测效率高,具有实际应用意义。应用：测定食品中对位红的残留量13仪器、试剂及色谱条件仪器设备Waters 2695 型高效液相色谱仪。Waters、996型二极管阵列紫外检测器。MilliQ p lus型超纯水器,美国Millipore公司产品。超声波清洗器。试剂对位红标准品(95% ,Acros Organics, USA) ;乙腈(分析

10、纯和色谱纯) 。色谱条件色谱柱,MERCK L ichrocart 250 - 4 L ichrospher100 RP -18, 4 250 mm, 5m; 流动相: 水+乙腈( 5 + 95 ) ; 流速:110 ml/min;检测波长: 485 nm;进样量: 10l。142.1 .分光光度法-紫外可见分光光度计应用范围：1.检定物质 根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长虽ax和摩尔吸收系数是检定物质的常用物理参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。在国内外的药典中，已将众多的药物紫外吸收光谱的最大吸收波长和吸收系数载入其中，为药物分析提供了很好的手段。 2.与标准物及标准

11、图谱对照 将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标 准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。 3.比较最大吸收波长吸收系数的一致性 4.纯度检验 5.推测化合物的分子结构 6.氢键强度的测定 实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不 同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂 。 7.络合物组成及稳定常数的测定 8.反应动力学研究9.在有机分析中的应用 15简介 在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法。16三、对位红检测方案的确定结论：选用高效液相色谱法理由：对位红的熔点为248-252度，很难汽化，明显不能用气相色谱法来进行检测。 以高效液相色谱法的检测为基础的方法成本相对较低，且应用广泛。 根据学校实验室器材选择的要求可知，选用高效液相色谱法满足要求。17测定所需仪器：UV7504型紫外可见分光光度计，比色皿，材料与试剂：对位