猪唾液酸粘附素的分段表达及功能鉴定#

1、 中国科技论文在线- PAGE 7 - FORMTEXT 猪唾液酸粘附素的分段表达及功能鉴定基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20093702120004）；国家自然基金项目（U0931003，30871857） FORMTEXT 肖一红1， FORMTEXT 邱洪凯2， FORMTEXT 刘岳3， FORMTEXT 崔然3， FORMTEXT 周恩民4作者简介：肖一红（1976-），女，副教授，主要研究方向：免疫病理学通信联系人：周恩民（1957-），男，特聘教授，主要研究方向：免疫生物学. E-mail: zhouemSET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5

2、SET bkCompanyEN College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;College of Veterinary Medicine, Shandong Agricu

3、ltural University, Taian 271018;Veterinary Immunobiology Research Institute, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling City 712100 * MERGEFORMATCollege of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultu

4、ral University, Taian 271018;College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;Veterinary Immunobiology Research Institute, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling

5、 City 712100SET bkCompanyCHN 山东农业大学动物科技学院 泰安 271018;山东农业大学动物科技学院，泰安 271018;山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018;山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018;西北农林科技大学， 杨凌 712100 * MERGEFORMAT山东农业大学动物科技学院 泰安 271018;山东农业大学动物科技学院，泰安 271018;山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018;山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018;西北农林科技大学， 杨凌 712100SET bkPostcode 271018;712100 *

6、MERGEFORMAT271018;712100SET bkMobile18792713536 * MERGEFORMA18792713536SET bkTelphone 05388249851-8106* MERGEFORMAT05388249851-8106ET bkAddress 山东省泰安市岱宗大街61号山东农业大学动物科技学院;陕西省杨凌镇西农路西北农林科技大学动物医学院 * MERGEFORMAT山东省泰安市岱宗大街61号山东农业大学动物科技学院;陕西省杨凌镇西农路西北农林科

7、技大学动物医学院SET bkEmail ;zhouem * MERGEFORMAT;zhouemSET bkIntroduction 肖一红（1976-），女，副教授，主要研究方向：免疫病理学;周恩民（1957-），男，特聘教授，主要研究方向：免疫生物学 * MERGEFORMAT肖一红（1976-），女，副教授，主要研究方向：免疫病理学;周恩民（1957-），男，特聘教授，主要研究方向：免疫生物学SET bkAuthorCHN 肖一红;邱洪凯;刘岳;崔然;周恩民 * MERGEFORMAT肖一红;邱洪凯;刘岳;崔然;周恩民SET bkAuthorEN XIAO Yihong;QIU Hong

8、kai;LIU Yue;CUI Ran;ZHOU Enming * MERGEFORMATXIAO Yihong;QIU Hongkai;LIU Yue;CUI Ran;ZHOU EnmingSET bkContact 周恩民 * MERGEFORMAT周恩民SET bkFund 高等学校博士学科点专项科研基金（20093702120004）；国家自然基金项目（U0931003，30871857） * MERGEFORMAT高等学校博士学科点专项科研基金（20093702120004）；国家自然基金项目（U0931003，30871857）SET version 1.5 * MERGEFORM

9、AT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET bkReferencesInfo 1*|*期刊*|*Goyal S. Porcine reproductive and respiratory syndromeJ. J Vet Diagn Inve

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17、玉峰等. Ubiquitin基因介导下的PRRSV GP5基因免疫特性研究J. 中国科技论文在线，2007，2（2）：83-87. * MERGEFORMAT1*|*期刊*|*Goyal S. Porcine reproductive and respiratory syndromeJ. J Vet Diagn Invest 1993, 5: 656-664.2*|*期刊*|*Meulenberg J, Petersen-den B, Kluyver E, et al. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelysta

18、d virusJ. Virology, 1995, 2063*|*期刊*|*Indik S, Valcek L, Klein D, et al. Variations in the major envelope glycoprotein GP5 of Czech strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virusJ . J Gen Virol, 2000, 81: 2497-2502.4*|*期刊*|*Mardassi H, Mounir S, Dea S. Molecular analysis of the ORFs

19、3 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Quebec reference strain J. Arch Virol, 1995, 140: 1405-1418.5*|*期刊*|*周海范, 夏平安, 崔保安, 等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的克隆与变异分析J . 中国兽医学报, 2007, 27(6) : 111-113.6*|*期刊*|*Pirzadeh B, Dea S. Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encodi

20、ng ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virusJ . J Gen Virol, 1998, 79: 989-999.7*|*期刊*|*Vanderheijden N, Delputte P, Favoreel H, et al. Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophagesJ. J Virol. 2003, 77,

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22、, Hao X F, et al. Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, ChinaJ. Emerg Infect Dis. 2007, 13(9): 1434-1436.11*|*期刊*|*Duan X, Nauwynck H J, Favoreel H W, et al. Identification of a putative receptor for porcine reproductive andrespiratory syndrome virus on porcine alveolar ma

23、crophagesJ. J Virol. 1998, 72, 45204523.12*|*期刊*|*Mardassi H, Massie B, Dea S. Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virusJ. Virology, 1996, 221: 98-112.13*|*期刊*|*Mardassi H, Mounir S, Dea S. Molecular an

24、alysis of the ORFs 3 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Qubec reference strain J. Arch. Virol., 1995, 140:1405-1418.14*|*期刊*|*蒋文明，汤玉瑜，李玉峰等. Ubiquitin基因介导下的PRRSV GP5基因免疫特性研究J. 中国科技论文在线，2007，2（2）：83-87.SET bkAuthorsInfo |1|肖一红|XIAO Yihong|山东农业大学动物科技学院 泰安 271018|College of Vet

25、erinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018|肖一红（1976-），女，副教授，主要研究方向：免疫病理学|山东省泰安市岱宗大街61号山东农业大学动物科技学院|271018|05388249851-81062|邱洪凯|QIU Hongkai|山东农业大学动物科技学院，泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018|3|刘岳|LIU Yue|山东农业大学动物科技

26、学院， 泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018|4|崔然|CUI Ran|山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018|*|5|周恩民|ZHOU Enming|西北农林科技大学， 杨凌 712100|Veterinary Immunobiology Research Institute, Colleg

27、e of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling City 712100|周恩民（1957-），男，特聘教授，主要研究方向：免疫生物学|陕西省杨凌镇西农路西北农林科技大学动物医学院|712100|zhouem18792713536 * MERGEFORMAT|1|肖一红|XIAO Yihong|山东农业大学动物科技学院 泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 27101

28、8|肖一红（1976-），女，副教授，主要研究方向：免疫病理学|山东省泰安市岱宗大街61号山东农业大学动物科技学院|271018|05388249851-81062|邱洪凯|QIU Hongkai|山东农业大学动物科技学院，泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018|3|刘岳|LIU Yue|山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricult

29、ural University, Taian 271018|4|崔然|CUI Ran|山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018|College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018|*|5|周恩民|ZHOU Enming|西北农林科技大学， 杨凌 712100|Veterinary Immunobiology Research Institute, College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling

30、City 712100|周恩民（1957-），男，特聘教授，主要研究方向：免疫生物学|陕西省杨凌镇西农路西北农林科技大学动物医学院|712100|zhouem18792713536SET bkTitleInfo 猪唾液酸粘附素的分段表达及功能鉴定|Expression and characterization of PRRSV sialoadhesin fragments|高等学校博士学科点专项科研基金（20093702120004）；国家自然基金项目（U0931003，30871857） * MERGEFORMAT猪唾液酸粘附素的分段表达及功能鉴定|Express

31、ion and characterization of PRRSV sialoadhesin fragments|高等学校博士学科点专项科研基金（20093702120004）；国家自然基金项目（U0931003，30871857）（1. 山东农业大学动物科技学院 泰安 271018；2. 山东农业大学动物科技学院，泰安 271018；3. 山东农业大学动物科技学院， 泰安 271018；4. 西北农林科技大学， 杨凌 712100）SET bkTitleInfo * MERGEFORMAT SET bkAuthorsInfo * MERGEFORMAT 摘要： FORMTEXT 为了验证猪S

32、m(pPSn)与PRRSV囊膜糖蛋白GP5的关系，提取PAM总RNA，用分段RT-PCR方法克隆得到p猪PSn全长基因，并进行了核苷酸序列测定。将5个分段基因克隆入pET-28a，进行诱导表达和纯化，用SDS和Western blot方法对表达的蛋白进行了鉴定，用ELISA方法检测了5个分段蛋白与分段表达的GST融合GP5分段蛋白的相互关系进行了研究。结果表明扩增出了pPSn的5个分段基因，与GenBank中登录的序列的同源性为99%。5个分段基因克隆人pET-28a，经诱导后用SDS和Western blot验证均得到了表达。ELISA结果表明PSn-3能与GST-GP5-1蛋白结合。通过用

33、ELISA方法鉴定分段表达pPSn蛋白片段与分段表达的GP5的关系，表明pPSn-3能与GST-GP5-1蛋白结合，为了解PRRSV的感染细胞机制奠定基础。关键词： FORMTEXT 关键词1；关键词2；关键词3（关键词36个，分号隔开）要能反映文章的基本观点，避免广义词。第一个关键词为该文内容所属二级学科名称中图分类号： FORMTEXT 请查阅中国图书馆分类法SET bkAuthorsInfo * MERGEFORMAT SET bkTitleInfo * MERGEFORMAT FORMTEXT Expression and characterization of PRRSV sialo

34、adhesin fragments FORMTEXT XIAO Yihong1, FORMTEXT QIU Hongkai1, FORMTEXT LIU Yue1, FORMTEXT CUI Ran1, FORMTEXT ZHOU Enming2(1. College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018;2. Veterinary Immunobiology Research Institute, College of Veterinary Medicine, Northwest A &

35、F University, Yangling City 712100)Abstract: FORMTEXT In this paper to identify the relationship of sialoadhesin and envelope glycoprotein GP5, 5 fragments of whole procine PSn (pPSn) were cloned from porcine alveolar phagocyte cells by RT-PCR. After all the fragments sequenced they were cloned into

36、 pET-28a vector and expressed. The purified proteins were identified by SDSand Western blot. The relationship of fragments proteins and fragments of GST-GP5 were analysed by ELISA. The results showed that all the fragments were cloned and expressd. They all were the target proteins by identification

37、 of SDSand Western blot. The results of ELISA showed that fragment of PPSn-3 could bind with GST-GP5-1. The binding of PPSn with GP5 was confirmed by identification of ELISA, and it would help to learn more about the infection mechanism of PRRSV.Key words: FORMTEXT PRRSV; sialoadhesin; GP5; expressi

38、on; function引言猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种能够引起能够引起猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的急性传染病。该病以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍，各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征1，已成为危害世界养猪业的首要传染病。PRRSV是一种含有囊膜的RNA病毒，呈球形，大小为4583 nm，属于动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus），其RNA是单股正链，约15kb2-3。基因组

39、含有8个开放阅读框(ORF)，ORF1编码病毒RNA复制酶，ORF2、3、4、5、6和7分别编码病毒的结构蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白4。GP5是PRRSV的主要结构蛋白，位于病毒囊膜上，含有4个糖基化位点，不仅可在体内诱导产生病毒中和抗体，而且在PRRSV感染细胞的过程中起着重要的作用5-6。病毒感染细胞是个非常复杂的过程，该过程涉及了多种机制和多种蛋白，其中细胞受体是介导病毒入侵的决定因素。病毒必须找到细胞受体才能入侵到宿主细胞，完成生命周期。PRRSV侵入宿主细胞也是首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用而感染易感细胞。猪唾液酸粘附素（porcine

40、sialoadhesin，pSn）是的PRRSV的一个细胞受体，与PRRSV结合和入侵细胞有关7，但对于pSn通过与PRRSV哪个蛋白的作用完成的还未曾研究。为了进一步研究PPSn与PRRSV感染之间的关系，本研究将克隆并分段表达，研究了分段pSn蛋白与GP5蛋白的关系，为PRRSV的致病机制的研究奠定理论基础。材料与方法主要试剂RNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA聚合酶、AMV、RNase inhibition、T4连接酶、限制性内切酶EcoR、Sal均购自TaKaRa公司，DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司，anti-HIS单克隆抗体购自南京金斯瑞公司，TRI

41、zol Reagent 购自Invitrogen公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自Jackson，ELISA板购自NUNC公司，其它常规试剂均为国产分析纯。载体与蛋白pET-28a（+）载体及其宿主菌E.coli DH5和E.coli BL21 DE3由本实验室保存；GST-GP5蛋白（27-200aa）、GP5-1（27-69aa），GP5-2（45-110aa），GP5-3（77-164aa）、GP5-4（127-200aa）、GST蛋白均由本实验室其他人员表达纯化。引物根据GenBank中登录的pSn序列（No：NM-214346）设计了5对特异性引物，分别带有EcoR和Sal酶切位点。

42、如表1所示。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。表1 扩增pSn的引物Tab 1 primers of porcine Sialoadhesin片段引物预期大小pSn-11F：TATGAATTCGGCCTGGCCTCGTGGACG1R：TAGTCGACGCACCTCGCAGAAGTAGAAGCCC1125bppSn-22F：CGCGAATTCCACTCAGTTACCAG2R：TAGTCGACGGCTCACGTTGCAAGTCAGG1062bppSn-33F：TGGAATTCAACGCCTCCGCCTCT3R：TAGTCGACGGTAGACGCCTTCATC1101bppSn-44F

43、：TAGAATTCCCTCGCCAGGCCACACTCAC4R：TAGTCGACGCATCTCGGCAGGTGGCTC1182bppSn-55F：TAGAATTCGGCACACGCATCTCCCAG5R：GCGTCGACGTCAGACTGTGCTTTTC1200bp注：斜体为限制性内切酶EcoR和Sal酶切位点。猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar phagocyte, PAM）的制备及RNA提取取PRRSV抗体阴性猪肺用灭菌的细绳对气管进行结扎。用灭菌的PBS冲洗出肺巨噬细胞，重复2次。反复吹打后过滤，1,500rpm，离心10min。用RPMI-1640重悬细胞，放于37，5%

44、 CO2恒温培养箱中2h。将细胞刮下，用TRIzol根据说明书提取细胞总RNA。pSn分段基因的克隆测序用表1中设计合成的特异性下游引物为引物，RT扩增目的片段，其反应体系参考AMV的说明书制定，将混合物混匀后放置42水浴锅中，2h。以RT产物为模板，以表1中序列为引物，参考聚合酶说明书制定反应体系和循环参数进行PCR扩增，扩增的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。与预期大小相符的片段经胶回收试剂盒回收后，连接到pMD18-T克隆载体上，转化至DH5感受态细胞，经PCR和酶切鉴定后，挑取含目的片段的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。重组质粒pET-28a（+）-pSn-15

45、的构建及鉴定以测序正确的重组pMD18-T pSn-15载体为模板，分别以表1中的序列为引物扩增目的条带，；用T4连接酶将用EcoR/Sal双酶切的PCR产物和pET-28a（+）空载体链接后转化至DH5感受态细胞，挑取单克隆用PCR和酶切鉴定。重组质粒pET-28a（+）-pSn-15的诱导表达含重组质粒pET-28a（+）-pSn-15的阳性质粒转化到含有Kan+抗性的大肠杆菌Rosetta感受态细胞，25-37振摇培养，当OD600达到0.61.0之间，用IPTG终浓度为0.1-1.0mM，25，200rpm诱导1-8h。凝胶脱色后对表达产物用BandScan5.0进行薄层凝胶扫描分析，

46、测定表达产物的相对含量,以确定最佳的诱导温度、IPTG浓度及时间。表达产物的鉴定及纯化将1.7中的表达产物煮沸后用SDS蛋白质电泳进行分析。SDS电泳后的蛋白转移到PVDF膜上，用抗His的单抗进行Western-blot分析鉴定。用1.8中的诱导条件分别诱导表达重组蛋白pSn-15，收集菌体，超声波破碎后，将沉淀溶于8M尿素，溶解产物离心过滤后，用Ni-NTA按其说明书进行纯化。ELISA 检测pSn分段蛋白与GP5的关系及结果判定以5个纯化的pSn分段蛋白为抗原，包被浓度为400ng/孔。封闭后分别加入GP5各分段蛋白、GP5全长蛋白和GST蛋白（作为对照），每种蛋白分别设置四个浓度梯度：

47、100g/ml、10g/ml、1g/ml和0.1g/ml。以抗GST标签单抗（0.2g/ml）作为一抗。以HRP-GoatMouse IgG（1:2000）作为二抗。以经过TMB底物显色以后在酶标仪上以OD450nm波长读数。结果判断OD值大于对照平均值+3标准差为阳性，否则为阴性。结果唾液酸粘附素的PCR扩增结果通过RT-PCR方法，对猪肺巨噬细胞中的唾液酸粘附素进行全基因组扩增，根据所设计的5对特异性引物，分别得到了含有目的基因的cDNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳知扩增目的条带的大小与预期结果一致，大小分别为1125bp；1062bp；1101bp；1182bp和1200bp，（如图1所示）

48、。序列测定结果与GenBank中登录的序列比对结果发现其核苷酸的同源性为99%。重组质粒pET-28a-pSn-15的鉴定结果通过特异性引物进行PCR扩增和EcoR/Sal双酶切及其序列测定进行阳性质粒鉴定。序列测定有上海生工生物工程技术服务有双酶切结果如图2所示：图 2 重组质粒pET-28a-pSn-15鉴定MDNA分子质量标准；1、4、5、7、9分别为pSn-15片段PCR鉴定结果；2、3、6、8、10为重组质粒pET28(a+)-pSn-15双酶切鉴定结果。Fig 2 Identification of recombinant plasmids pET-28a-pSn-15M. DNA

49、 marker; 1、4、5、7、9 are the PCR identification of pSn-15; 2、3、6、8、10 identification of recombinant plasmids pET28(a+)pPSn-15/ EcoRand Sal图1 PSn-15 PCR结果MDNA分子质量标准；1 pSn-1：1125bp；2 pSn-2：1062bp；3 pSn -3：1101bp；4 pSn-4：1182bp；5 pSn-5：1200bp。Fig 3-5 PCR results of PSn-15M. DNA marker; 1 pSn-1: 1125bp; 2

50、 pSn-2: 1062bp; 3 pSn-3:1101bp; 4 pSn-4: 1182bp; 5 pSn-5: 1200bp.重组质粒pET-28a (+)-pSn-15的表达重组质粒pET-28a-pSn-15转化入大肠杆菌Rosetta感受态细胞，经IPTG诱导表达，经12%SDS电泳检测。结果显示：重组菌体在25条件下诱导6h后表达量达到最高，且诱导产物以包涵体的形式存在，表达量占到菌体总蛋白的32.5%60.1%。5段蛋白的相对分子量与预期结果一致，结果如图3所示。62KD 40KD 中国科技论文在线20KD 94KD 14KD 图3 重组质粒pET-28a-pSn-15表达M蛋白

51、质分子质量标准；1、3、5、7、9分别为pET-28a-pSn-15诱导前全菌蛋白；2、4、6、8、10分别为pET-28a-pSn-15诱导后的全菌蛋白，大小分别为41.4KD、36.7KD、38.5KD、42.3KD、42.9KD。Fig 3 Expression of recombinant plasmids pET-28a-pSn-15MProtein marker; 1、3、5、7、9 the whole protein before induction; 2、4、6、8、10 the whole protein after induction, 41.4KD、36.7KD、38.5

52、KD、42.3KD、42.9KD, respectively. 重组蛋白pSn-15 纯化及鉴定纯化的重组蛋白pSn-15经转膜后，可与抗His-单克隆抗体发生特异性的结合，出现特异性目的条带。如图4所示。94KD GP5各蛋白与PSn-5 检测结果Fig. 9 Result of GP5 proteins and PSn-5 94KD 图 9 GP5各蛋白与PSn-5 检测结果Fig. 9 Result of GP5 proteins and PSn-5 62KD 40KD 30KD 20KD 图 4 纯化蛋白的Western blot 鉴定结果M蛋白质低分子量标准；1-5分别为5段蛋白的W

53、estern blot鉴定结果，大小分别为Fig 4. Western blot results of purified proteinsMProtein marker; 1: Western blot results of pSn-1-5, 41.4KD、36.7KD、38.5KD、42.3KD、42.9KD, respectivelyELISA 检测pSn分段蛋白结果ELISA结果显示 GP5-1与pSn-3OD值超过了阳性判定标准，因此判定为阳性。其余的OD值均不能达到阳性判定标准，因此判定为阴性。图5.1-5.5。图 5.1 GP5各蛋白与pSn-1检测结果Fig. 5.1 Resul

54、t of GP5 proteins and pSn-1 图 5.2 GP5各蛋白与pSn-2 检测结果Fig. 5.2 Result of GP5 proteins and pSn-2 图 5.3 GP5各蛋白与pSn-3 检测结果Fig. 5.3 Result of GP5 proteins and pSn-3 图 5.4 GP5各蛋白与PSn-4 检测结果Fig. 5.4 Result of GP5 proteins and pSn-4 图 5.5 GP5各蛋白与PSn-5 检测结果Fig. 5.5 Result of GP5 proteins and pSn-5 讨论PRRS是目前危害全

55、球养猪业的重要传染病之一，我国于1996年首次报道8，自2006年以来出现了一种由高致病性PRRSV引起的高致病性PRRS，以发病率和死亡率高、传播迅速为特征，在半年内几乎传遍了大半个中国9-10，给我国养猪业带来了巨大的经济损失，是造成我国猪肉价格上涨的重要原因，影响了全国人民生活水平的提高。因目前缺乏有效的药物和疫苗，对其致病性的研究显得尤为重要。pSn全长基因为5193个碱基，编码1730个氨基酸，是免疫球蛋白超家族成员之一，是一种局限于巨噬细胞的凝集素，参与细胞与细胞相互作用，主要由部分分化的巨噬细胞亚群表达。唾液酸粘附素分子的，该基因序列中GC含量较高。病毒感染细胞必需借助于细胞表面

56、的受体蛋白。1998年，Duan等用抗PAM的单克隆抗体发现通过免疫沉淀技术在PAM上得到了一个分子量210Kd的多糖蛋白质PRRSV细胞受体，经序列分析后证明此受体是pSn11。将重组的pSn基因转导PRRSV非易感细胞后，此种细胞可被PRRSV感染，但病毒不能进一步的繁殖，由此进一步证明pSn只参与PRRSV结合和侵入细胞7。为了进一步研究pSn与PRRSV感染的关系。将全长pSn分成5个片段进行扩增，每段长度在10001200bp之间，同时这五个片段中相邻的两个片段中间存在着部分重叠区域。这5个蛋白均得到了高效表达。PRRSV囊膜糖蛋白GP5，分子量大小约为25ku，虽然GP5在PRRS

57、V感染的细胞内表达水平较低，但却是病毒主要的免疫原性蛋白。在不同毒株间GP5基因是各结构蛋白中变异最大的。该蛋白呈很强的疏水性，含有多个疏水区：包括一个信号肽序列（第131个氨基酸）及2个跨膜区域（65130aa及170-190aa），可能与蛋白在膜上的锚定作用有关12-14。通过ELISA试验研究了GP5全长蛋白及GP5分段蛋白pSn的各分段蛋白的相互作用关系，发现GST-GP5-1能够与pSn-3，而GST-GP5 蛋白及GST-GP5其他各段蛋白则不反应。结合GST-GP5全长蛋白不与pSn反应来看，GP5蛋白与pSn受体的结合可能不是在PRRSV吸附在细胞膜上时，而是在PRRSV被进一

58、步内吞时暴露出了GP5上的某个抗原表位从而能够与pSn受体结合。Marc-145细胞膜上并无pSn受体，只有PAM细胞膜上才有PSn受体，当然，要证实以上推论还需要大量试验结果的支持。结论本文将pSn全长分段克隆表达后，将表达产物纯化后，用ELISA方法研究了分段pSn蛋白与GST-GP5的各分段蛋白的关系，结果表明pSn能与GP5结合，这为PRRSV的感染细胞的机制提供了理论依据，为PRRSV致病机制的研究奠定基础。参考文献 (References)Goyal S. Porcine reproductive and respiratory syndromeJ. J Vet Diagn Invest 1993, 5: 656-664.Meulenberg J, Petersen-den B, Kluyver E, et al. Characterization of proteins encoded by O