基因克隆酶学基础(3)

1、关于基因克隆的酶学基础 (3)第一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1. 简述核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸键发生水解断裂的蛋白酶。分为两类：从核酸分子末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链的叫核酸外切酶（exonuclease）;从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）核糖核酸酶（RNase）：水解断裂RNA分子脱氧核糖核酸酶：特异水解断裂DNA分子核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组DNA技术赖以创立的酶学基础第二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月限制性内切酶主要用

2、于DNA分子的特异切割 DNA连接酶用于连接两条DNA分子或片段反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 多核苷酸激酶将一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-OH末端碱性磷酸酶催化从DNA分子的5或3端移去末端磷酸基团核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。2. 重组DNA实验中的工具酶及其运用第三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第一节 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割1.1 寄主控制的限制与修饰现象在K株或B

3、株上生长繁殖的噬菌体（K）或（B），再次感染原寄主菌株的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和410-4（K）在感染B菌株后长出的稀有噬菌斑中的噬菌体再次感染B菌株则可以有效地生长两种酶的配合：修饰的甲基转移酶与核酸限制性内切酶 （EcoB and EcoK）第四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.2 限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到H

4、indII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。 第五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月国王和仆人的故事分子剪刀 每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一些培养皿，里面装的是菌群。它们就象一个住着许多居民的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、高高的。国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父亲把国王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有记载。对于我们人类来说，国王记载的这些细目是个谜。我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就

5、像一把剪刀，如果有外国国王来侵犯一个细菌，这个仆人就会把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密，他们搜集了很多带剪刀的仆人，并把他们放进一个国王里，这个国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎片使人类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着剪刀的仆人而获得了诺贝尔奖。瑞士微生物遗传学家W阿尔伯（1929）的女儿西尔维娅 第六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.3 核酸内切酶的类型第七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.4 I型和III型核酸限制性内切酶的基本特性I型和III型核酸限制性内切酶一般是大型的多亚基蛋

6、白复合物，既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性。I型核酸限制性内切酶的特性 辅助因子： Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸） 三种不同的亚基： 特异性亚基：特异识别DNA序列 修饰亚基：具有甲基化酶的活性 限制亚基：具有核酸内切酶活性 切割方式：结合在识别位点以滚环形式沿着DNA分子转位，而后从距识别位点5一侧数千碱基处随机切割DNA分子。第八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月III型核酸限制性内切酶的特性 辅助因子： Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸） 两种不同的亚基： M亚基：位点的识别与修饰 R亚基：核酸酶的活性 切割方式： 反应过程中会沿着DNA分子移动，并

7、从距识别位点一侧约25bp处单链切割DNA分子。 其识别序列是特异而非对称的。 第九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.4 II型核酸限制性内切酶的基本特性II型只有一种多肽，通常以同源二聚体形式存在。 1.在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子产生链的断裂； 2.两个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的； 3.断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。识别序列：双重旋转对称（回文结构）第十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 1. 识别顺序和酶切位点 ）识别、6、8个相连的核苷酸 BamHI：HhaI：NotI：Fok I ： 5-()9-

8、3 3-()13-5 外侧，产生-端突起IIs型第十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 2）对称性双对称 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 3）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 4）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和- 2.末端种类 ）-端突起，个数为或个核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCAOH PG-3 3-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-5 ）-端突起，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5第十二张，PPT共

9、六十二页，创作于2022年6月 ）平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互补的粘性末端 i）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ii）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG 第十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月）相容性末端如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3

10、AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C。第十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月3 同裂酶（isoschizomers）定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 （产生同样的切割，形成同样的末端）用以研究DNA甲基化作用：一对同裂酶：HpaII和MspI，识别序列同为CCGG，当靶序列中含

11、一个5-甲基胞嘧啶（CCGG）时，HpaII不能切割它而MspI则同样能切开，因此可通过比较HpaII和MspI的DNA消化产物来检测胞嘧啶的甲基化。第十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月4. 同尾酶（isocaudamer）定义：来源不同,识别不同序列但产生相同粘性末端的限制酶 5. 限制片段末端的连接作用许多种限制酶切割DNA分子形成的短片段能够自发地重新环化起来，用DNA连接酶处理能使它们的3-OH和5-P基团封闭起来形成永久的环形DNA分子。两种类型：DNA分子间和分子内第十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 1.5 限制性内切酶的命名命名原则：（1）用属名的头一个

12、字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称；（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型；（3）几个不同的限制与修饰体系以罗马数字表示。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I ()第十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.6 影响限制性内切酶活性的因素1. DNA的纯度DNA中的污染组分如蛋白质、酚、氯仿、酒

13、精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子都有可能抑制核酸限制性内切酶的活性。克服手段： 增加酶的用量 扩大酶催化反应的体积，使得潜在抑制因素被稀释 延长酶催化反应的时间对于DNase的污染，可加入二价金属离子螯合剂EDTA结合Mg2+。加入适量聚阳离子亚精胺有利于限制性内切酶对基因组DNA的消化作用。第十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2. DNA的甲基化程度 采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒 使用对甲基化不敏感的酶3. 酶切温度大部分酶的最适反应温度为37，但也有一些低于或高于此温度，严格参照说明。4. DNA的分子结构DNA分子的螺旋结构、切割靶序列所处的位置对酶切速率有影

14、响，一些酶对不同部位的限制位点的切割活性也有差异。第十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月5. 酶反应的缓冲液缓冲液成分包括：MgCl2、NaCl或KCl、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。各种酶对以上成分的浓度要求都有所差异，若某些酶的敏感因子浓度改变较大可能造成酶的非特异切割。酶的星号活性：在非最适条件下，限制性内切酶会在与其识别序列类似但并不相同的DNA序列上切割。 第二十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月表1 具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI 1, 2, 4BamHI 1 - 5, 8

15、G GATCN, G PuATCCBstI 2, 4BsuI 2, 4, 6EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTNHae 2, 4HhaI 2, 4, 7Hind 6HpaI 1, 2, 4PstI 1, 2, 4, 7Pvu 2, 4SalI 1, 2, 4, 7ScaI 4 - 6, 8 Sst 2, 4XbaI 2, 4, 7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)； 5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。 第二十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.7 限制性内

16、切酶在实验中的使用当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。 在 50 l体系中，最适反应条件下，1 单位（U）的限制性内切酶可以在60 分钟内完全切割 1 g 的底物 DNA。 大多数科研人员会遵循右表中所列的标准反应条件，使用 510 倍的过量酶切割DNA，这样有利于克服由于 DNA 来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败 “标准”反应体系 第二十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 酶从冰箱取出后请一直置于冰上。 酶最后加入到反应体系中。 加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹

17、打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。 当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋 DNA 时，通常需要超过 1 unit/g 的酶量以达到完全酶切。实验操作注意事项 建议在 50 l 反应体系中消化 1 g 底物 DNA。 为避免星号活性，甘油浓度应 5 %。 加入内切酶（贮存于 50% 甘油中）的量应不超过总体积的 10%。 大多数内切酶建议保存在 -2 0。只有少数内切酶若贮存时间超过 30 天建议保存在-70。 第二十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液并避免星号活性是非常重要的一步。 分步酶切应从推荐缓冲液盐浓度低

18、的酶开始，温育至酶切完毕。调整缓冲液中盐浓度（用小体积浓缩盐溶液）直至满足第二种酶的要求。加入第二种酶完成双酶切反应。也可在第二步酶切反应前过柱纯化 DNA。 第二十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第二节 DNA连接酶体外连接DNA片段的方法：用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段用T4 DNA连接酶直接将平末端DNA片段连接起来，或用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA加上poly(dA)-poly(dT)尾巴后再用DNA连接酶连接先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端后，在用DNA连接酶连接第二十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1. D

19、NA连接酶催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键需要：3-OH、5-P以及NAD+或ATP做能源不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA必须是双螺旋DNA分子的一部分nickgap第二十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月DNA连接的分子机理第二十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月连接反应的影响因素 1. 连接缓冲液的影响：合适酸碱度，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白

20、质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。2. ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，过浓会抑制反应。由于ATP极易分解，含有ATP的缓冲液应于-20保存，溶化取用后立即放回。最好小管分装贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。第二十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37。为了解决这一矛盾，在经过

21、综合考虑后，传统上将连接温度定为16，时间为4-16h。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、载体与插入片段的量适当的载体与片段的摩尔比能提高连接效率，并减少多拷贝插入片段的的形成，一般：载体插入片段=13-10第二十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2. 粘性末端DNA的连接DNA片段与载体用同一种内切酶酶切后，利用DNA连接酶将酶切形成的粘性末端连接起来单酶切时如何阻止载体的自我环化？实验中普遍采用片段和载体用不同的酶双酶切形成不同的粘性末端，这种操作具有方向性第三十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第三十一张，PPT共六十二页，创

22、作于2022年6月3. 平末端DNA的连接直接用T4 DNA连接酶（需要ATP及高浓度酶）（1）同聚物加尾法第三十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月（2）衔接物连接法第三十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月双衔接物连接法第三十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月（3）DNA接头连接法第三十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月练习题第三十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第三十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月TMTC：too many to count第三十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月答案：第三十九张，PPT共六十二页，创

23、作于2022年6月第三节 DNA聚合酶DNA聚合酶能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。第四十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1. DNA聚合酶I在50年代的中期，A. Kornberg发现了DNA聚合酶（DNA polymerase ，DNA pol ）原来称为Kornberg酶。以后又相续发现了DNA pol 和DNA pol 。DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3 OH；（3）合成的方向都是53；（4）除聚合DNA外还有其它功能。冈崎片

24、段第四十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.DNA聚合酶I（polI）三种酶催活性：5-3 聚合酶活性5-3 核酸外切酶活性3-5 核酸外切酶活性polI催化合成DNA的三种条件：（1）存在四种dNTPs和Mg2+（2）带有3-OH游离基团的引物链（3）DNA模板（双链或单链）链合成方向：5 3第四十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月polI的5 3聚合作用第四十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月polI的5 3核酸外切酶活性（切除修复）必须是位于双螺旋的区段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端数个核苷酸远的磷酸二酯键；伴随发生的DNA合成可以增强5-3外切酶

25、的活性；对双链DNA的单链缺口有活性但要存在5-P基团。用枯草杆菌蛋白酶切割成两个片段，一个片段36kDa具有5-3外切酶的活性;另一片段76kDa具有聚合酶活性及3-5外切酶活性，此即为Klenow片段。第四十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月polI的3 5 核酸外切酶活性（校正）从DNA链3-OH末端开始水解DNA并释放单核苷酸分子，底物可以是双链的DNA也可以是单链的DNA。当反应物中缺乏dNTPs时，3-5外切酶活性将从3-OH开始降解DNA。但在具有dNTPs的条件下，这种降解活性会被5-3的聚合酶活性所抑制。第四十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月DNA缺口转

26、移，制备放射性标记的DNA探针PolI、DNaseI、 32P-dNTPs、未标记的dNTPs第四十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2. DNA聚合酶I的Klenow片段具有5-3聚合酶活性、3-5外切酶活性用途：（1）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；（2）标记DNA片段的末端；（3）cDNA克隆中的第二链cDNA的合成；（4）DNA序列测定第四十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月3. T4 DNA聚合酶两种酶催活性：5-3聚合酶及3-5外切酶用来标记DNA平末端或隐蔽的3-末端第四十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月4. Taq DNA聚合酶Taq

27、 DNA聚合酶是从一种水生栖热菌（Thermus aquaticus）yT1株分离提取的。yT是一种嗜热真菌，能在7075生长。 Taq酶的特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。 70延伸率大于60个核苷酸/秒 第四十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月Taq DNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，

28、而无35外切活性，因而，在pCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶没有校正功能的，30次循环Taq酶的错配率约为0.25 应用低浓度的dNTP(各20molL)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10-6次/（核苷酸*循环）。 Taq 酶的性质第五十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月Taq 酶的性质Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3端加上个碱基，尤其是dATP最容易加上。用于TA克隆Taq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/LMg2+浓度下68时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在

29、，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的扩增。 第五十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月Taq 酶的选择高特异性Taq酶 最典型的代表是热启动Taq酶 如何减少引物和模板的非特异性配对？ 第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品。 新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列 热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础 第五十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月高

30、保真Taq酶 经基因工程改造，具有3 -5 外切酶活性（校验功能）扩增效率降低，不宜用于TA克隆如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA聚合酶，QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体 。高耐热性Taq酶 NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq 酶耐热性的三倍以上，前者在95C半衰期近7小时，100C近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。 第五十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月超长片段扩增Taq酶 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb 。第五十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月5. 逆转录酶（1） AMV（鸟类骨髓母细胞瘤病毒）反转录酶 肽链：具有反转录酶与RNaseH活性（RNaseH：核糖核酸外切酶，以5-3 或3 -5 方向特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链） 肽链： 5-3脱氧核酸外切酶 （以RNA-DNA杂交分子为底物）依赖于RNA