高效转化及感受态细胞的制备

1、关于感受态细胞及转化克隆/建库/表达专用超级咼效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了-如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2-3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。生物通在 这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。Stratagene的XL10-Gold?几乎算得上是高效转

2、化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连 接DNA和建库，克隆甲基化 DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold?和其衍生菌。XL10-Gold? 用途包括：-克隆大DNA :包括表达质粒，基因组 DNA克隆-构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转 化效率更接近，提高文库代表性（比 DH10B高25倍）。Hte基因型Hte （高效转化）基因型是 Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。XL10-Gold? , BL

3、21-Gold , BL21-CodonPlus? , SoloPack? Gold 和 96Pack? Gold 等系列细胞都 带有这个新的性状。超级感受态细胞Stratagene提供多种5 x10 9转化子/卩g超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是 克隆获得大质粒、连接 DNA克隆和建库时最值得推荐的。电转化感受态细胞效率1X1010 ）电转化感受态细胞均具有endA基因型，保证质粒优质高产；recA 重组缺陷基在DNA材料极珍贵、量少时,Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用,或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。ElectroTe n-Bl

4、ue? 细胞是目前商品化的电转化感受态细胞中效率最高的，达到 3 x10 10转化子/卩g超螺旋DNA。此外XL1-Blue , XL1-Blue MRF , SURE? , ABLE? 和TG1等细胞也提供电转化形式感受态细胞。SURE?克隆不稳定 DNA大肠杆菌DNA修复系统会针对重复序列、二级结构（如 Z-DNA ）等真核DNA进行重排或删 除修饰。SURE感受态细胞针对 uvrC,umuC,SbcC 和RecJ等参与修饰的大肠杆菌基因或蛋白进行 突变，提高了真核来源、不规则DNA的稳定性达20倍以上，并且适合克隆甲基化DNA。提供化学和电转化感受态细胞，效率分别达1x10 10和1x1

5、0 9。ABLE?克隆毒性 DNA目的DNA的蛋白产物常常对细胞产生毒性，通常的解决办法是采用低拷贝质粒，或者采用极为严紧的表达调控。为了获得稳定的克隆，ABLE细胞减少ColE来源质粒的拷贝数（如 pUC、pBluescript系列载体），以达到保持相对较高拷贝数的同时使本底表达对于细胞的毒性降至最低的 效果。MR系列？一克隆甲基化DNA真核基因组DNA常常因高度甲基化而被大肠杆菌修饰系统切割、删除，在构建文库时，由于要对cDNA进行甲基化保护，某些cDNA克隆也较难完成。采用Stratagene的MR （Minus Restriction） 突变删除了修饰系统的感受态细胞，可以构建质量非常

6、高的cDNA和基因组文库。这些细胞包括：用于大质粒克隆的 XL10-Gold?超级感受态细胞，克隆连接DNA、转化效率 目前最高的ElectroTen-Blue? 电转化感受态细胞，单次反应包装的SoloPack? Gold ，以及 XL2-Blue MRF ,XL1-Blue MRF Kan （四环素抗性质粒），XL1-Blue MR （没有F附加体），克隆有二级结构的 SURE 细胞等。重点推荐Stratagene 的 ElectroTen-Blue （转化效率 3X1010 ）和 Novagen 的 Nova XG Zappers （转化因型适合甲基化 DNA克隆，确保片段不被删除或重排

7、；能以IPTG诱导进行蓝白斑筛选（lacZ M15）,也使这两种细胞非常好用。此外，ElectroTen-Blue 还可被M13单链噬菌体感染（F）。感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议1、 在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管。1支用来转化样品，1支做pUC18 对照。同时将 NZY+ broth培养基在42 C预热。在转化实验中使用圆底14-ml BD Falcon聚丙烯试管（货号#352059 ）也是关键之一。一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。2、 冰上融化感受态细胞。融化时轻轻将细胞混匀并分装成100

8、ul/管。3、 每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME （巯基乙醇）。4、 温和转动试管，将细胞在冰上放置10分钟，每2分钟温和转动一下。5、 每管细胞加入0.1 -50 ng样品DNA （或2 ml连接反应物）（参见DNA质量与体积说明。）用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA，并取1 ml稀释的pUC18 DNA 加入转化细胞。6、 温和转动试管，并在冰上放置30分钟。7、试管在42C水浴热激30秒。热激时间对转化效率极度重要。8、试管冰浴2分钟。9、 每管加入 0.9 ml预热（42 C）的NZY+肉汤，37C、225 t250 rpm 摇床培养1小时。10、 取200

9、 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板（如果进行颜色筛选还需 加入IPTG和X-gal ）。pUC18阳性对照则取5 ml铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板。注意：细胞经1000 rpm离心10分钟会聚集，应将细胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉汤重悬。如果 用于铺板的细胞 100 ml，先将细胞加入200 ml培养基中，然后用灭菌涂布棒铺板。 如果采用?100 ml细胞则可以直接铺板。倾斜涂布棒并轻轻拍打，尽量减少涂布棒上的细胞残留。11、 37 C培养过夜。颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南。12、pUC18阳性对照预计有约 250个克

10、隆(？5 X109 cfu/mg pUC18 DNA )。而样品 DNA的转化效率随DNA的量和组成(超螺旋或连接产物)有较大差异，大质粒和非超螺旋DNA往往得到较少的克隆。高效感受态细胞制备方法一：效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。实验试剂：A 液：1M，MnCl2B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液 称取CaCI2 0.10g ，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121 C高压灭菌备用。

11、取1管B液(0.6ml )，全部加入 C液(46ml)中，混匀后，再用 1ml移液器加入3.3ml A液， 混匀冰浴即可使用。实验步骤：1、划线得到单菌落,37 C培养箱培养约17小时。2、 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶，37 C剧烈振荡(300 rpms )培养3-4小时。3、 将培养温度调至18 C剧烈振荡(3280 rpms )培养，其余与普通感受态差不多。4、每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。5、加入280ml DMSO （可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。6、用纱布将所有装有感受态的 E

12、P管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置 12 小时以上。7、取出感受态放入-70 C超低温冰箱备用。注意事项：1、洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。2、离心力要注意不要超过 2500g,建议1500-2000g 5min。3、涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。4、涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。5、预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。方法二：本法效率极高，建议大家采纳。实验步骤：1、 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, J

13、M109,HB101等，在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。2、挑直径1-3毫米的单菌落*可多个，接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的 SOB培 养基. 培养基量不可再多，会影响效率。3、 在18度150-250RPM 培养19-50小时。没有冷却摇床的可在室温，但不可高于37度。4、OD600约0.4-0.8时停止培养，放在冰水中冷却10分钟。5、4度，300RPM 离心15分钟，回收菌体。6、 去掉上清后，用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10分钟。7、再次离心回收菌体。8、用1/12.5体积的TB悬浮,添加最终浓度为 7%的DMSO,再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装，直接在液氮中冻上。9、在液氮或-80度保存。10、 将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37 C培养活化。11、 挑取经活化的大肠杆菌单菌落于