染料木素的抗诱变性检测

1、染料木素的抗诱变性检测染料木素是一种从大豆种子中发现的重要营养成分， 属于黄 酮类植物雌激素， 黄酮类植物雌激素是一类具有苯环与色酮环基 本结构的化合物。 目前研究已发现黄酮类植物雌激素具有多种生 理活性作用，对激素依赖性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌 等有防治作用，同时还具有抗氧化、抗辐射和免疫调节等作用 1-2 。通过流行病学和动物模型研究也发现，染料木素与一系 列潜在的有益健康的生理作用有关， 其中包括防治乳腺癌、 前列 腺癌、心血管疾病和绝经后疾病等 3-5 。小鼠淋巴瘤细胞实验是一种用于初筛诱变剂和致癌物质的体外实验。目前常用于检测化合物抗诱变性的实验有Ames实验、彗星实验、微核

2、试验、 HPRT基因突变实验、染色体畸变实 验等，由于这些实验一般仅能检测到单一的遗传毒性效应， 故通 常需要一组实验以全面评价受试物的遗传毒性。 小鼠淋巴瘤细胞 实验不仅可以检测出点突变、 小缺失、重组等小范围的基因突变， 还能检测出包括 tk 位点在内的大的缺失、染色体畸变等大范围 的损伤，因此将小鼠淋巴瘤细胞实验用于诱变性检测具有高灵敏 性、检测范围广等优点。 目前关于小鼠淋巴瘤细胞实验用于化学 物的抗诱变性评价， 除本实验室已做过一些相关工作外， 其他的 研究报道尚不多见。 本研究利用小鼠淋巴瘤细胞实验检测染料木 素的抗诱变性， 一方面为其开发和利用提供安全性依据， 另一方 面也可为将

3、小鼠淋巴瘤细胞试验应用于抗诱变性检测累积更多 的资料。1 材料与方法细胞系L5178Y 3.7.2C tk+/- 细胞，由日本国立研究所本间正充提 供。细胞培养使用含10焙血清，200 u g/mL丙酮酸钠，100 U/mL青霉 素和100 u g/mL链霉素的RPMI1640培养液培养，培养于 37C, 5%二氧化碳（CO2培养箱中。受试物染料木素购于成都市药品生物制品研究所， 使用时用二甲基 亚砜（DMSO将其溶解成不同浓度溶液。染料木素的抗诱变性检测1.4.1试剂 甲基磺酸甲酯（MMS、丝裂霉素C（MMC、RPMI 1640培养基、马血清、三氟胸苷（TFT）、丙酮酸钠、二 甲基亚砜（DM

4、SO、次黄嘌呤、甘氨酸、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核 苷、维生素 C（VitC ）均购于 Sigma 公司。1.4.2剂量设计 预实验中，利用 MM（作为诱变剂，采用同 时处理方式（MMCf染料木素同时作用 L5178Y细胞3 h）确定实 验剂量。当染料木素为0.625 u g/mL时，相对悬浮生长率（RSG 较小，为45%48%表现出明显细胞毒性。因为考虑在多数情况下，RSGRS上述处理情况下的 RS可能在10%- 20%勺理想范 围内，因此染料木素正式试验的剂量定为0.078、0.156、0.312、0.625卩g/mL（阳性诱变组），另外再设一个阳性诱变对照组 （MMS 5卩g/mL或MMC 0

5、.5卩g/mL）、溶剂对照组（0.5% DMSO和阴 性对照组（纯水）以及抗诱变阳性对照组 （VitC 100卩g/mL+ MMS 5 卩 g/mL 或 MMC 0.5 卩 g/mL）。清除自发突变 参照文献 7 进行。受试物处理细胞 将L5178Y细胞调至2X 105个/mL, 每瓶10 mLo在抗诱变实验中，采用前处理、同时处理和后处理3种处理方式，按1%加入不同浓度受试物（染料木素）和MM或MMC前处理时，先加入受试物处理3 h再加入MM或MM（处理3 h ;同时处理时，受试物和 MMS或 MM（同时处理细胞3 h ;后 处理时，先加入 MMS或 MM（处理3 h再加入受试物处理细胞 3

6、 h。 处理结束后，1000 r/min离心10 min，弃上清液，用 PBS缓冲 液洗涤细胞 2 次，重新悬浮细胞于含 10%马血清的 RPMI 1640培 养液中，并调整细胞密度到 2X 105个/mLo1.4.5平板接种效率测定 将上述细胞梯度稀释至 8个/mL, 按每孔0.2 mL接种96孔培养板，每一剂量接种1块平板。于 37 C、5%CO饱和湿度条件下培养14 d后，计数每块培养板有 集落生长的孔数, 计算第 0天的平板接种效率 （PE0）o“1.4.4 ” 中剩余细胞继续培养 2 d，每天计数并维持细胞密度在 1 X 106 个/mL以下。表达培养结束后，按上述 PE0方法测定培

7、养2 d的平板接种效率（ PE2）1.4.6 表达培养 将“ 1.4.4 ”中的剩余细胞调整细胞密度为2X 105个/mL,表达培养2 d，同时每隔24 h计数1次，并 调整细胞密度为2X 105个/mL，计算相对悬浮生长率（RSG。147总突变频率（TMF测定取经表达培养2 d的细胞， 将细胞密度调整为1X 104个/mL,按1%加入100X TFT,使其终 浓度为3卩g/mL,然后将细胞悬液加到 96孔板中，每孔加200 卩L,即每孔有2000个细胞。每个剂量组做 2个平行平板，在 5%CO2 37C饱和湿度培养箱中培养 12 d后，肉眼计数每块平板 的集落生长孔数。148计算方法PE0和

8、PE2 （第0天、第2天平板效率）、 RS （相对存活率）、RSG RTG（相对总生长率）、TMF等计算方 法和结果判定标准参照文献 8 。1.5 统计学方法在英国环境诱变剂学会指南推荐的Mutant （tm）软件中，使用Dunnett t检验对TMF进行统计分析，以PMMC乍为诱变剂时，染料木素各剂量组 RS RSG和RTG高于阳性诱变对照 组（MMG3.5卩g/mL）,表明在本实验条件下，染料木素可拮抗 MMC勺细胞毒性作用。在前处理条件下，染料木素各剂量组与阳 性诱变对照组比较TMF降低，差异有高度统计学意义（PGrzesiuk E. The role of mutation frequ

9、ency decline and SOSrepair systems in methyl methanesulfonate mutagenesisJ. Acta Biochimica Polonica，1998，45（2）： 523.Latt SA. Sister chromatid exchanges， indices ofhuman chromosome damage and repair ： detection by fluorescence and induction by mitomycin C J. Proceedings of the National Academyof Sci

10、ences ，1974，71（ 8）：3162-3166.Tomasz M，Lipman R，Chowdary D， et al. Isolation and structure of a covalent cross-link adduct between mitomycin C and DNA J. Science，1987， 235（4793）：1204-1208.Yang YD ， Fix D. Reduction of ENU-induced transversion mutations by the isoflavone genistein in Escherichia coli J. Mutat Res， 2001， 479（ 1-2 ）： 63-70.Pugalendhi P，Manoharan S， Panjamurthy K，et al. Antigenotoxic effect of genistein against 7 ， 12-dimethylbenzaanthracene induced genotoxicity in bone marrow ce