lab-sop pcr xm007人乳头瘤病毒6,11型核酸检测操作荧光探针法

1、人瘤6,11型核酸检测标准操作规程（PCR荧光探针法）1.目的：规范人瘤(HPV)6,11型核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。2.应用范围：PCR。3.职责：3.1文件编写：技术员。3.2文件审核：主管。3.3文件：。3.4执行：PCR所有。4. 参考文献：4.1中山大学人瘤（6,11型）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书4.2中山大学DA7600核酸序列检测系统用户手册5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。5.2 实验原理：采用一对特异性引物和一条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即

2、高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测人瘤（HPV）6,11型DNA。5.3 性能参数：5.3.1 检测下限： 5.0102拷贝/ml。5.3.2 线性范围：5.01025.0108拷贝/ml。5.4 标本：由合作按照以下要求进行。5.4.1 标本类型：泌尿生殖道物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。5.4.1.1物：用细小棉拭子约24厘米，捻动拭子物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（物前2小时禁小便）。5.4.1.2 女性生殖道物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外物，再用宫颈刷或无菌棉拭子宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子宫颈物，将宫颈刷或棉拭子

3、置于无菌试管中，密封送检。5.4.1.3 女性物：用无菌生理盐水棉球洗净口，再用无菌棉拭子约2厘米，捻动拭子物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。5.4.1.4 生殖道刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞，置于无菌玻璃管中，密封送检。5.4.1.5 组织活检标本（包括宫颈组织、组织、疣状组织等）：取可疑组织适量置于无菌玻璃管中，密封送检。5.4.2 标本保存：标本后保存于28。5.4.3 运送条件：标本运送采用冰壶。5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4、-20）、移动/固

4、定紫外灯、冷冻离心机。5.5.2 试剂：5.5.2.1试剂品牌：中山大学结结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒5.5.2.2试剂批准文号：国药准字 S20060097。5.5.2.3试剂组成：DNA 提取液（500L/管）2 管；（HPV） 6,11-PCR 反应管（未贴）20人份；（HPV ）6,11阳性质控品（50L/管）1 管；质控品（500L/管）1 管。5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20；有效期6个月。5.6 操作过程：5.6.1 标本的处理：5.6.1.1打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100。5.6.1

5、.2从试剂盒中取出DNA提取液，让其在室温下完全融化。5.6.1.3泌尿生殖道物棉拭子的处理：5.6.1.3.1向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子。5.6.1.3.2吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，12,000rpm离心5min。5.6.1.3.3去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100恒温处理101min。5.6.1.3.412,000rpm离心5min，待用。5.6.1.4 生殖道刮片的处理：5.6.1.4.1 向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀。5.6.1.4.2 吸取全部液体转至1.5ml EP管中，12,000rpm离心5

6、min。5.6.1.4.3 其余步骤同泌尿生殖道分泌物棉拭子处理的3、4步骤。5.6.1.5 组织活检标本的处理：5.6.1.5.1 用适量灭菌生理盐水送检组织沾带的血液。5.6.1.5.2 取约50毫克组织置于干净器皿中，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min。5.6.1.5.3 去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100恒温处理101min。5.6.1.5.4 12,000rpm离心5min，备用。5.6.2 排版：在DA7600荧光定量扩增仪的上机面板表里设置面板。5.6.3 加样： 从-20冰箱取出HPV 6,

7、11-PCR 反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接加入处理好的样本DNA 5L，2,500rpm 离心1 min。5.6.4 DA7600荧光定量扩增仪的设置及结果分析：参见PCR扩增检测及结果分析操作规程。5.6.5实验数据。5.6.6 取出结束后扩增仪内扩增产物需用手套包好、后，丢入医疗废物桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。5.6.7 关闭扩增仪电源和计算机电源。5.7 临床意义：直接反映内人瘤（HPV）6,11型是否存在及其活跃程度，可作人乳头瘤（HPV）6,11型的辅助及其疗效监测的标准。5.8 安全防护措施：5.8.1 试剂处理：5.8.1.1使用或更换试剂时，务

8、必戴手套；不要用身体直接接触试剂，以免损伤皮肤。5.8.1.2如果皮肤接触了试剂，立即用大量清水冲洗并。5.8.1.3如果眼睛接触了试剂，立即用喷淋器冲洗，并紧急就医。5.8.2 仪器使用：5.8.2.1仪器运转中不要触摸加样机构、试剂分注机构、搅拌机构、反应容器机构等可动部分。5.8.2.2 仪器通电时不能打开仪器上面、背面、侧面的盖板，不能触摸光源灯的玻璃面。5.8.3 生物安全防护：参见生物安全防护手册。5.9 注意事项：5.9.1PCR荧光定量检测法比较容易受污染，所以实验过程中应避免反复开盖，所用耗材均需高压灭菌。5.9.2试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。5.9.3试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。6.相关表格：6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001PCR实验、交表6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001PCR迟发登记表6.3LAB-SOP-PCR-014-T01-001PCR不