分子遗传学课件：17-基因治疗

1、第十一章 基因治疗（Gene Therapy）第十一章 基因治疗 现在已经证明小英的疾病是由于HERG基因发生突变而引起的，普通药物已经很难完全控制其疾病的发展。那么，有没有办法改善其病程？ 基因治疗（Gene therapy） ：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。一、基因治疗策略1、直接基因治疗：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。 导入外源正常基因，没有去除或修复有缺陷的基因。用DNA重组技术设

2、法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。 第十一章 基因治疗二、基因治疗的途径： 1、生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。 2、体细胞基因治疗：将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。第十一章 基因治疗三、基因治疗的方法： 1. 目的基因的获得 人工合成 逆转录 基因组DNA 第十一章 基因治疗 2. 外源基因的转移 物理方法：电穿孔法、显微注射法、微粒子轰击法 化 学法 ：磷酸钙沉淀法、脂质体

3、(Liposome) 融合法 病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer） 感染细胞重组病毒第十一章 基因治疗 逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 逆转录病毒（retrovirus） 病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 第十一章 基因治疗 第十一章 基因治疗 例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构： LTR LTR gag pol envU3 R U5 U3 R U5U3=增强子，R=启动子，U5=

4、转录起始位点。 =病毒包装信号，gag =核心抗原，pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。 第十一章 基因治疗逆转录病毒载体优点：高效感染宿主细胞，转染率可达100%病毒基因和所载的外源基因都可能表达宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留缺点病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；随机插入靶细胞基因组中，使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；有致癌作用，可能使受体细胞癌变。第十一章 基因治疗第十一章 基因治疗第十一章 基因治疗 受体载体转移法：将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。

5、重组质粒配体细胞膜复合物第十一章 基因治疗 同源重组技术（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。第十一章 基因治疗NEOMYCINXXNEOMYCIN第十一章 基因治疗Positive selection:- neomycin phosphotransferase (neo)- hygromycin phosphotransferase (hyg)- puromycine (pur)- hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt)Negative selection：- thym

6、idine kinase (tk)- cytosine deaminase (cd)- hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt)同源重组成果细胞的筛选：第十一章 基因治疗启动子缺失筛选法Poly-A缺失筛选法正负筛选策略（positive and negative election，PNS）HR112HR23HR1b-geoHR23HR1b-geoHR23Genomic LocusTargetingVectorMutant LocusHSVtkSTOP CODONS四、靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞 选择靶细胞的原则是：1）必

7、须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）4）易于受外源遗传物质转化。第十一章 基因治疗 常见的靶细胞外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等肝C家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗肌细胞第十一章 基因治疗 基因治疗的原则选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。第十一章 基因治疗 基因治疗的应用

8、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子） ADA缺乏症致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。第十一章 基因治疗 基因治疗的应用 乙型血友病（1991年我国基因治疗成功的例子，薛京伦） XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3-q27.2。 逆转录病毒载体 + F-cDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3患者皮肤成纤维细胞，治疗表达5%第十一章 基因治疗 基因治疗的应用 黑色素瘤的基因治疗 肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。 第十一章 基因治疗 基因治疗的应用自杀基因的基因治

9、疗 第十一章 基因治疗 基因治疗的应用 反义核酸基因治疗 第十一章 基因治疗肿瘤特异性基因治疗从单靶点打击到多靶点网络打击 黄 辰 西安交通大学医学院 环境与疾病相关基因教育部重点实验室基因治疗存在的问题与论理学1.导入基因的持续性和高效表达2.Gene治疗与社会伦理道德（生殖细胞基因治疗） 第十一章 基因治疗肿瘤生长的特点 多基因参与的生长调节失控 多基因参与的死亡抵抗 多基因参与的免疫逃逸 多基因参与的免疫抑制 肿瘤治疗药物的缺陷 单通路、单靶点药物开发 肿瘤治疗的非特异性副作用现有基因治疗的手段 癌基因的抑制 抑癌基因的添加 药物敏感基因的添加 免疫增强 肿瘤疫苗 肿瘤基因治疗的靶点筛选

10、 ERK1/2在肿瘤发生过程的作用 ERK1/2及其通路成员在多数肿瘤中过表达或突变。 ERK1/2参与细胞周期调控。 ERK1/2参与细胞外基质MMP-9 的表达调控。 ERK1/2参与肿瘤化疗耐药的作用。 RNAi是实现定点打击的理想方法Andrew Z. Fire (Stanford University photo) Craig C. Mello (University of Massachusetts Medical School )Tree of RNA TypesDiscovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC. elegansNeg. co

11、ntrol UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizationMechanism of RNAidsRNA22nt siRNAstargetmRNAsecondary siRNAsamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingMechanism of RNAiC. elegansDrosophilaArab

12、idopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRPDicersiRNA5353RISCEffector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activationExamples of RNAihairpin

13、against pigmentGFP expressed in nucleiControl dsRNAGFP specific dsRNARed = silencing of GFPsiRNA针对RISC理性设计 从起始密码下游50100nt开始，避开5或3端的UTRs, 搜索AA(N19)序列。 有义链1位为G或C,19为A或U,双链5端能量应该比3端 高,即有义链15-19至少有3个A或U,或着13-19至少有5个A 或U。此原则最为重要。 siRNA5端必须磷酸化,3端悬垂两个UU。 对mRNA目标区域进行二级结构预测,排除那些作用于复杂 二级结构的siRNA序列。 Blast对照,并进

14、一步用mRNA相似性软件或脱靶控制软件 筛选,把脱靶控制到最小水平。 避免出现连续的多个G或C,GC含量最好在30%-52%之间,16 位最好为C,13位最好为非G。 遗传 2006，28（11）：1457-61siRNA-针对RISC理性设计 二级结构遗传 2006，28（11）：1457-61siRNA-针对RISC理性设计 siRNA的不对称性遗传 2006，28（11）：1457-61siRNA的-针对RISC理性设计argo蛋白的结构域遗传 2006，28（11）：1457-61Chemically synthesized SiRNAAdvantagesNo hands-on tim

15、ePurity of siRNA:97% by PAGE or HPLCSynthesis can be scaled upCan be labeledPotential therapeutic useDisadvantagesDuration:inappropriate for knock-out modelPrice:oligo synthesizer, starting materialIn Vitro Transcribed siRNAsIn Vitro Transcribed siRNAsAdvantagesPriceShorter turn-around timeDisadvant

16、agesMore hands-onScalabilityPurityLower specificityIf long transcripted RNA, cocktail SiRNA usedVector-based SiRNAVectors expressing siRNAsU6H1siRNAVectors expressing siRNAsU6Sense sequenceAnti-sense sequenceHair-pin loopSense sequenceAnti-sense sequenceRNAi 体内合成用各种载体的比较载 体费用长 处短 处质 粒低可以比较简单地大量制备RNA

17、i效果持续时间短，导入效率低腺 病 毒高导入效率高，可感染静止期的细胞RNAi效果持续时间短，制备病毒较费时间逆 转 录 病 毒中RNAi效果持续时间长不能感染静止期的细胞RNAi 合成的方法比较合成方法特点适用不适用化学合成价格高已找到最有效siRNA，大量筛选体外转录毒性小，稳定 性好，效率高筛选大量，特定用RNAIII消化长片段节省快速而经济的研究某基因缺失表型不宜特定的siRNA研究，基因沉默体内表达价格较高，常用特定siRNA，稳定筛选 RNAi是实现定点打击的理想方法Huang C, Liu LY, Li ZF, Wang P, Ni L, Song LP, Xu DH, Song

18、 TS. Effects of small interfering RNAs targeting MAPK1 on gene expression profile in HeLa cells as revealed by microarray analysis. Cell Biol Int. 2008,32:1081-1090 RNAi是实现定点打击的理想方法 RNAi是实现定点打击的理想方法 本研究证明，siRNA有效抑制了MAPK P42的表达，并为肿瘤基因治疗的理想靶点。 肿瘤特异性表达系统是实现定点打击的前提国家自然科学基金（嵌合式肿瘤特异性启动子调节的ERK1/2 shRNA在肝癌基

19、因治疗中的实验研究，起止年月2009.120011.12，批准号：30872481。黄辰，主持人。）陕西省科技攻关项目（启动子调控的MAPK p42/44 shRNA胰腺癌治疗中的实验研究，起止年月2007.12009.12，批准号： 2006K09-G7-1。黄辰，主持人。）申报发明专利两项（siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，申请号：200710017857.4；肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，申请号:200910022879.9)miRNA DetailsOriginate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA)Hairpin precursor 70 nt (pre-miRNA)Mature miRNA 22 nt