2015年第09讲+冷冻电镜技术

1、1Cryoelelctron Microscopy 第九讲 冷冻电镜技术杨永亮2015年2生物电子显微术的发展50s Hall, Huxley, Brener 发明了负染技术;研究了生物材料。-分辨率2 nm。60s Klug 提出电子显微图像的三维重构理论;解析了烟草花叶病毒的结构。-1982 诺贝尔化学奖。70s Henderson, Uniwin 建立了电子晶体学;解析了膜蛋白bacteriorhodopsin的结构。-分辨率0.7 nm.80s Adrian & Dubochet 发明了快速冷冻技术- 冷冻电子显微术诞生。-分辨率0.2 nm.3负染法：用重金属染料堆积在分子周围，反衬

2、出分子结构优点：衬度大，易于观察缺点：染料颗粒较大，不能渗入分子内部所的结构是分子的外部形貌样品脱水分子变形分辨率低一般用于样品中分子数量和质量的初步观察负染法4是将样品的背景染色以突显样品，本身不会显示任何结构 5样品包埋处理冰冻法将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中优点：样品含水处于天然状态结构为真实结构分辨率高，0.2 nm缺点： 衬度低不易观察用于样品结构的高分辨分析及动态结构分析6冷冻电子显微术（cryo-electron microscopy)主要步骤样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态冰中样品转移，将样品转移到液氮或液氦冷却的低温冷台中样品观测及图像采集，在液氮或液氦温度进行7如何冷冻包埋

3、样品？150 一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻8冷冻包埋的质量控制ABCDA: 分布不均B: 样品污染C:理想样品1. 分布均匀2. 没有重叠3. 厚度均一D: 厚度不均9Principles of Electron-microscopy10冷冻电镜在房间内的安装11中科院生物物理所有一台清华有三台12电子剂量对图像质量的影响10e/220e/230e/240e/210e/220e/230e/240e/213电镜观测和记录由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采用低剂量技术（low dose technique)一般控制电子剂量 10 e/2低剂量技术寻找在

4、低倍下进行 （1-3k）聚焦在照像区域的相邻区域进行 （100-300k)记录区域仅在照相时受到辐射 （30-60k)14离焦量对信息传递的影响15电镜与三维图像重构16Electron MicroscopyWhy do we need 3D information?3D objectprojection2D photoDrawing by John OBrien, The New Yorker Magazine (1991)17三维图像重构在电镜下观察样品时，所看到的是样品在垂直于电子束方向的投影（二维信息）要得到样品的三维结构，须将投影信息（二维信息）转变为三维信息将二维信息组合得到三维信

5、息并得到三维结构的过程称为三维图像重构18The principle of 3D reconstruction三维物体二维投影二维投影的傅立叶变换三维傅立叶变换三维结构反傅立叶变换 Klug A, De Rosier DJ. Nature (1966), 212:29-32.19The effect of sampling18 Proj. / 10 deg.36 Proj. / 5 deg.72 Proj. / 2.5 deg.20电子断层技术(tomography)电子断层技术实际上是最为广泛应用的获取三维结构的方法。它通过重构一系列一定倾斜角度样品的二位投影来获取三维图像。样品或者光源与检

6、测器总的倾斜角度越大，而每次的增量越小，则获取的信息越多，重构图像的质量也就越高。21生物电镜三维重构方法方法研究对象 对象特点 分辨率电子晶体学 1. 二维晶体 周期排列 0.19 nm 2. 管状晶体 0.40 nm单颗粒技术 1. 病毒 全同粒子 0.38 nm 2. 大分子复合体 0.40 nm断层成像术 1.细胞器，细胞 单一结构 4.0 nm2. 组织切片22冷冻电子显微术及三维重构技术的应用23Three-dimensional Structure determination 24The Structure of BacteriorhodopsinEM: yellowX-ray:

7、 purple2526AchR的三维结构(Miyazawa et al, Nature 423, 949, 2003)Side viewTop viewTransmembrane 27简单到复杂Study complex structure28Brcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-5872009 by National Academy of Sciences29Structural model of the coronavirion based on tomogramsBrcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-5872009 by N

8、ational Academy of Sciences30HIV对宿主的感染31J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159=spikes32J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature071593D structure of the HIV-1 spike in complex with CD4 and 17b-Fab.33J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159Conforma

9、tional change in the gp120 trimerinduced by CD4 binding34Harris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of Sciences35Distributions and shape-based differentiation of HA and NA spikesHarris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of SciencesHA=neuraminidaseNA=ribonucleaprotein36离体到在体Study the structure of cell and tissue37Science ( 2002) 298:1209-1212Resolution: -5 nmThickness of the region observed: 200-350nmDictyostelium cells (网柄菌细胞)38组织的三维结构髓鞘的三维结构39冷冻电镜FEI F30 300kV FEG electron microscopeGatan US4000 4kx4k CCD cameraGa