猪水肿病与副伤寒病猪肝脏中病原菌的分离与鉴定

1、全国“那”工程重点建设院校微生物实践教学结题报告题目：猪水肿病与副伤寒病猪肝脏中病原菌的分离与鉴定指导老师：蒋文灿班 级：动检201101二0三年十二月猪水肿病与副伤寒病猪肝脏中病原菌的分离与鉴定陈德林 梁慧明陈前曾雅丽黄莞芸张鹏飞郑新疆 谢念王传富尹旭林（四川农业大学动物医学院动植物检疫（动物检验检疫）201101）指导老师：蒋文灿摘要：肠杆菌科的细菌种类众多，在自然界中管饭分布，能引起人和动物的多种传染性疾 病，尤其是消化道疾病，具有极其重要的公共卫生学意义。该科成员的形态相似，但各种 细菌的生化特性较为稳定具有重要诊断意义。本文将就猪引起猪水肿病的大肠杆菌和引起 猪副伤寒病的沙门氏菌做分

2、离与鉴定的简要介绍。关键词：大肠杆菌；沙门氏菌；分离；鉴定1实验依据肠杆菌科的细菌种类众多，在自然界中管饭分布，能引起人和动物的多种传染性疾病， 尤其是消化道疾病，具有极其重要的公共卫生学意义。尤其是能引起猪水肿病的大肠杆菌 和引起猪副伤寒病的沙门氏菌是其中最为人所知的，虽均为三类疫病，但因其四季均发的 特性每年均给我国的养猪产业，特别是农村地区的养殖户带来巨大的经济损失。据世界卫 生组织统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，中 国内陆地区也以沙门氏菌为首位。中毒后会产生严重的腹泻等消化道疾病症状，因此具有 重要的重要诊断意义。2材料 2.1样品来源 从宰杀猪的

3、肝脏无菌采集样品。2.2试验试剂 四硫磺酸钠煌绿（TTB ）增菌液、麦康凯琼脂、三糖铁培养基、营养肉汤 和营养琼脂。鉴定用生化管（硫化氢、靛基质、pH7.2尿素、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、 乳糖、蔗糖、MR、VP、枸橼酸盐）2.3实验器材试管、平板、高压蒸汽锅、接种环、凝集板、烧杯、量筒、锥形瓶、电子 天平、移液枪及枪头等。2.4培养基及制备方法2.4.1普通营养肉汤（150 ml ）（1 ）按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类在称取蛋白胨及牛肉膏）置于铝锅或搪瓷缸 中。牛肉膏（5 g ）蛋白胨（10 g ）氧化钠（5 g ）磷酸氢二钾（1 g ）蒸馏水（1 000 ml）（2 ）将上述成分混合加

4、热溶解后，以0.1 mol/L氢氧化钠溶液调整酸碱度至PH7.47.6o （3 ）将配好的肉汤分装于试管和锥形瓶中，塞上棉塞，用包装纸扎好待灭菌。（4 ）将培养基置于高盐蒸汽锅内，121 C灭菌1530 mino2.4.2麦康凯琼脂培养基（50 ml）蛋白胨17 g、嘛东3 g、猪胆盐（或牛、羊胆盐）5 g、氧化钠5 g、琼脂17 g、乳糖10 g、蒸馏水1 000 mL、0.01%结晶紫水溶液10 mL、0.5%中性红水溶液5mL。将蛋白东、东、胆盐和氧化钠溶解于400 mL蒸馏水中，校正pH7.2o将琼脂加入600 mL加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121 C高压灭菌15 min备用

5、。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50-55 C时，加入结晶紫和中性红水溶 液，摇匀后倾注平板。结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。2.4.3四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）基础液 蛋白东10 g、牛肉膏5 g、氧化钠3 g、碳酸钙45 g、蒸馏水1 000 ml ,除 碳酸钙外，将各成分加如蒸馏水中，搅拌混匀，静置约10 min，加热煮沸至完全溶解，再 加入碳酸钙，调至PH7.00.1,高压灭菌121 C, 20 min。硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠(含5个结晶水)50 g、蒸馏水、加至100 ml ,高压灭 菌 121 C, 20 min碘溶液 碘片20 g、碘化钾25 g、蒸馏水加

6、至100 ml。将碘化钾充分溶解于少量的 蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片完全溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，储 存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。0.5%煌绿水溶液 煌绿0.5 g、蒸馏水100 ml ,溶解后，存放暗处，不少于1 d，使 其自然灭菌。牛胆盐溶液 牛胆盐10 g、蒸馏水100 ml。加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121 C, 20 min。制备 基础液900 ml、硫代硫酸钠溶液100 ml、碘溶液20.0 ml、煌绿水溶液2.0ml、 牛胆盐溶液50 ml。临用前，按上列顺序，以无菌操作一次加入基础液中，每加入一种成 分，均应摇匀后再加入另一种成分。2.4.4三糖铁琼脂培养

7、基2.4.5伊红美蓝琼脂培养基3分离鉴定方法3.1猪副伤寒病原菌分离鉴定方法3.1.1菌株鉴别分离及纯培养 将取自猪肝脏无菌样品2 h内置于高压灭菌的PBS缓冲 液中混匀，用无菌吸头吸取混合液40pL接种于4ml TTB增菌液(x2), 37 C条件下200 r/min培养12 16 h后，用接种环取增菌液1环划线接种于一个麦康凯琼脂，将可疑单个 菌落接种另一麦康凯琼脂进行纯化，再将纯化的菌落接种于三糖铁琼脂及尿素琼脂斜面， 37 C培养27 h做进一步鉴定。3.1.2菌株鉴定染色镜检 对在三糖铁琼脂上表现为可疑的菌落进行革兰氏染色，观察细菌的形态 结构。生化鉴定将经革兰氏染色的可疑菌落接种硫

8、化氢、靛基质、尿素、氰化钾、赖氨酸 脱羧酶、甘露醇、山梨醇、进 行沙门氏菌属的生化鉴定。将判定的沙门氏菌再接种葡萄 糖、麦芽糖、甘露糖、MR、乳糖、蔗糖、尿素、VP、H2 S、枸橼酸盐、卫茅醇、鼠 李糖、木糖、阿拉伯糖、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶进一步做生化鉴定。3.2猪水肿病病原菌分离与鉴定3.2.1细菌鉴别分离及纯培养培养 用接种环无菌操作从病料中挑取病原菌，并接种于T TB增菌液中进行增菌培养，然后分别在血琼脂平板和麦康凯琼脂平板划线，于37 C培 养24 h。挑取疑似大肠杆菌菌落5-10个分别同时接种于TSI琼脂斜面鉴别和普通琼脂平 板进行纯培养。3.2.2抹片染色镜检 挑取分离到的可

9、疑单个菌落进行抹片、革兰氏染色和油镜观察细菌 形态排列及染色特性，镜检后将可疑单个菌落的剩余部分接于普通肉汤中做纯培养。3.2.3生化试验 将分离菌株分别接种于乳糖发酵管培养基、V-P培养基，MR培养基中， 37 C培养3 d，观察并记录生化反应结果。4结果4.1培养特性及菌落特征4.1.2培养特性鉴别培养基细菌麦康凯琼脂三糖铁琼脂斜面大肠杆菌红色斜面黄色，底层变黄有气泡，不产H2S沙门氏菌淡桔红色斜面红色，底层变黄有气泡，产H2S4.1.3菌落特征细菌名称大小形状边缘隆起度颜色透明度硬度培养基大肠杆菌中等圆形整齐平滑凸起灰白色半透明湿润普通琼脂沙门氏菌小圆形整齐平滑凸起灰白色半透明湿润普通琼

10、脂4.2镜检两者均为革兰氏阴性而两端钝圆的杆菌，无芽孢和荚膜，大小差异不显著，大肠杆菌 两端较钝圆。4.3生化鉴定大肠杆菌与沙门氏菌生化试验鉴别表细菌名称葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖吲哚试验 MR试验 VP试验枸橼酸盐H2S试验大肠杆菌v+-沙门氏杆菌-+-+注：产酸产气、+阳性、-阴性、+/-大多数菌株阳性/少数阴性、v种间有不同反应。5疾病的防治与治疗5.1猪水肿病5.1.1预防目前对本病尚无特异的有效疗法，预防本病关键在于改善饲养管理，饲料营养要全面， 蛋白质不能过高。药物治疗早期效果好，后期一般无效。1、在没有本病的地区，不要由病区购进新猪，邻近猪场发生本病，应做好卫生防疫 工作。在有本

11、病的猪群内，对断乳仔猪，在饲料中添加适宜的抗菌药物。切忌突然断乳和突然更换饲料，断乳时防止突然改变饲养条件，断乳后的仔猪不要饲喂过饱。猪舍清洁、 干燥、卫生，定期冲洗消毒。2、仔猪断奶前710天用猪水肿多价浓缩灭活菌苗肌注12毫升，可预防本病发生。3、每批仔猪转入前和转出后，应把猪舍、门窗、墙壁、地面等用水冲干净，再用2 .5% 的氢氧化钠喷洒消毒，以喷湿为宜。母猪转入产仔舍前3天，用0 . 5%的高锰酸钾或者1 : 600百毒杀喷洒消毒。母猪产仔后应每天清理一次粪尿，保持产仔舍的干燥与清洁，每隔 2天用0.5%的高锰酸钾消毒一次，有利于杀灭圈舍及周围环境的致病菌。4、在母猪临产前40天和15

12、天，分别肌肉注射仔猪大肠杆菌K88、K99、987P三价 灭活苗，每次每头2毫升，以增强母猪血清和初乳中大肠杆菌的抗体。怀孕母猪临产前第 7天和第2天，分别肌肉注射猪水肿抗毒注射液10毫升，可确保所产仔猪85 . 71%得到 保护。加强哺乳母猪的饲养管理，并在饲料中添加0.2%的金霉素饲喂。仔猪断奶前后皮 下注射K88和K99基因工程苗三分之一头份，可明显降低腹泻及水肿发病率。5、仔猪生后哺乳之前，给仔猪口服0 . 1%的高锰酸钾2毫升3毫升，以后每隔5 天再喂饮一次。在仔猪3日龄4日龄肌肉注射富铁力1毫升或牲血素1毫升，0 . 1%亚 硒酸钠2毫升，能有效补充铁和硒的不足。3日龄5日龄饮用淡

13、盐水，7日龄补食富含蛋 白质和维生素的饲料，以促进器官发育，适量增加粗纤维饲料。6、仔猪35日龄40日龄断奶为宜。断奶前1天5天逐渐减少喂乳次数，严禁突然 断乳。调整饲料配方，增加矿物质和维生素含量，3周龄内蛋白质不高于19%。饲料应多 样化，保持饲料新鲜洁净。断奶初期补料要坚持少量多次的原则。断奶后限喂一周青饲料， 逐渐增加精饲料。7、断奶后一个月内，每100公斤饮水或饲料中加1公斤2公斤食醋或柠檬酸，以 提高胃内酸度。定期给予金霉素、土霉素、痢特灵、喹乙醇、磺胺类、亚硒酸钠、维生素 B粉等药物，对防治仔猪腹泻和水肿病有明显效果。5.1.2治疗1、恩诺沙星46毫升肌注，每日2次，连用3天；0.1%亚硒酸钠34毫升，肌肉注 射，间隔56天重复注射一次。2、头孢止痢每千克体重0.10.15毫克口服或肌注，不可超量，也不必与其它药配合 应用。3、硫酸卡那霉素每千克体重25毫克肌注，一日2次，连用3天。剂量准确，不可超 量。5%葡萄糖200毫升静脉注射。4、20%磺胺嘧啶钠10毫升或六甲氧磺胺嘧啶10毫升肌肉注射，每天2次，连用35 天；5%氧化钙和4%乌洛托品各