环氧化物水解酶

1、微生物环氧化物水解酶引言环氧化物水解酶广泛分布于动物界(包括人类)，在肝脏中，环氧化物水 解酶主要分布在内质网网上，最近的研究表明，它也分布于肝细胞的核膜、 胞浆中，而在环氧化物酶体、溶酶体和线粒体中缺失。环氧化物水解酶以多种同工酶形式存在，酶的单体相对分子量为 48k-54k之间，没有血红蛋白和黄素做辅基。环氧化物水解酶也可催化内源性和外源性的环氧化物，其中对内源性 环氧化物的速率远大于外源性的环氧化物。因为环氧化物水解酶在致癌物 的形成中扮演一定角色，所以被作为肝癌的早期标志二受到广泛关注！环氧化物(epoxide )在多种生物体的代谢过程中广泛存在，又在多种生物活性物质的合成 中被广泛应

2、用，它们是一类很有价值的手性有机合成砌块和中间体。环氧化物具有环氧乙烷 三元环，该环中各原子的轨道由于不能在正面充分重叠，而是以弯曲键连接，因而具有较强 的张力，其碳氧键具有很强的亲电性，故其能与各种亲核试剂反应，通过选择性开环及官能 团转换，就可以很方便地合成很多种光学活性物质，而且它们的反应活性高，其开环反应中 通常具有极好的位置选择性和立体选择性。环氧化物水解酶(epoxide hydrolase)又称环氧化物水合酶(epoxide hydratase)或环氧化物水化 酶(epoxide hydrolase)，能立体选择性地将水分子加到环氧底物上生成相应的手性1,2-二醇。 应用此酶，能

3、够得到具有光学活性的剩余环氧化物和相应的二醇化合物。该酶在生物体内的 外源性化合物代谢中起着重要的作用。因此，环氧化物水解酶在生物体内，尤其是微生物体 内，是普遍存在的。一、选育对细菌EH的研究最早是在1967年，Schroepfer等人在Pseudomonad(NRRL.2994)中发现 7EH，并利用该酶成功催化水解了环氧油酸。此后奥地利的K.Fabe究小组开辟了对微生 物环氧化物的研究。细菌环氧化物水解酶在自然界中普遍存在，分组成型和诱导型两大类。前者的底物适用 性较广，可以很高的对映体选择性水解各种2取代的环氧化物，例如：1,1-二取代，2,2-二取 代和2,3-二取代，但其比活力都不

4、高，但是对于无分支的末端l,2-环氧化物的选择性较低，且 对于内消旋环氧化物的活性较低。后者的底物域相对较窄，是和诱导物结构相似的环氧化物， 比活力较高。对用真菌环氧化物水解酶进行环氧化物的不对称水解反应的研究开始得更早。始于1972年日 本Suzuk i等人用Helminthospsrum sativwn对一种萜类环氧化物10,11-环氧法呢醇进行对映体 选择性开环。但是对其真正的研究是在1993年由法国的Furstoss等展开的。真菌环氧化物水 解酶一般是组成型酶，一般可以用廉价的普通碳源进行大规模培养生产。其底物范围相对较 广，对取代脂环族、芳香族和无分支的脂肪族末端l,2-环氧化物具有

5、特别高的立体选择性。 其中真菌中的酵母细胞由于培养简便且易于从发酵液中分离，适合大规模的工业化生产，具 有良好的应用潜力。研究发现，许多丝状真菌的环氧化物水解酶是组成型酶，其底物范围广， 对映体选择性高，尤其是对含有芳香基团、取代脂环基的环氧化物的选择性很高，是一种非 常具有潜力的工业用生物催化剂。二、酶学特性理化特性温度目前的环氧水解酶基本都是常温酶。通常情况下酶在室温下是比较稳定的，反 应温度较低时，适当提高温度，会加速反应的进行，但继续提高反应温度，会导致酶的失活 加剧，并极大地降低酶的对映选择性。但也有某些酶，对温度比较敏感，在这种情况下，可 选择较低的温度，如在4C进行酶催化水解反应

6、。pH环氧化物比较活泼，在酸性条件下容易自发水解，这种化学水解是非选择性的， 它将极大地降低酶催化水解产物的对映选择性(ee值)，这极大地限制了环氧水解酶催化反应 的pH范围。此外，过酸性或过碱性的环境也容易引起酶的失活，故环氧水解酶催化的反应， 通常都是在中性或偏碱性条件下进行。助溶剂大部分环氧化物的水溶性很差，添加水互溶性的有机助溶剂可部分地解决这 个问题，增强底物的水溶性，消除传质的限制，加速反应的进行。但助溶剂的添加也会造成 酶的失活，且随着助溶剂浓度的提高，其失活效应加强。助溶剂对反应的影响是上述两个效 应共同作用、平衡的结果。表面活性剂表面活性剂同样可以提高水不溶性物质在水中的分散

7、度。阴离子表面活 性剂会降低酶的活性，同时降低其选择性;两性离子表面活性剂对酶活和选择性有轻微的促 进效应;而部分非离子型表面活性剂对酶活和对映选择性有显著的提升作用，尤其是当表面 活性剂的浓度远高于临界胶束浓度时，在一定浓度范围内，其对酶活和对映选择性的提升效 果随表面活性剂浓度的升高而提高。此外阳离子表面活性剂对酶有较强的负面影响。底物浓度当酶催化剂/底物一定时，通常随着底物浓度的升高，酶的对映选择性提高， 可用界面激活效应进行解释。当底物浓度相同时，通常随着催化剂浓度的提高，反应选择性 上升。催化特性对映体选择性(Enantioselectivity)对映体选择性指环氧水解酶可以选择性地

8、水解底物的某种构型，所筛选的各种酶中，微 生物来源的酶普遍优先水解R-构型的环氧化合物，留下S-构型底物，而来源于人体以及几种 植物的环氧水解酶则优先水解S-构型环氧化物。区域选择性(Regioselectivity)对于大多数酷的动力学拆分来说，在反应过程中对映体中心的绝对构型总是保持不变。 但环氧水解酶催化的反应与此不同，环氧化物的酶水解可能通过对环氧乙烷的任一个碳进行 攻击而发生，当亲核攻击发生在非取代的碳原子上，产物的绝对构型保持不变与次相反， 当亲核攻击发生在取代的碳原子上，产物的绝对构型发生反转，这种现象也称之为构型逆转。对映会聚(Enantio convergent)和 选择性互

9、补(Selectivity complementary)对映会聚现象是指使消旋的混合物变成单一的对映体的现象。选择性互补是指两种酶催 化同种环氧化物时，一种优先选择R-构型，而另一种优先选择S-构型，则这两种酶是选择 性互补酶用两种选择性互补的环氧化合物水解酶共同催化环氧化合物的水解，可以实现对映 会聚。三、催化机制要研究EH催化环氧化物开环反应的作用机制，就应先对EH的结构进行研究。现在 已经有90多种环氧化物水解酶被分离纯化和测序，其中一半以上被确定是蛋白质。从前面的 研究结果分析判断，EH结构中的核心部分.亲核基团和组氨酸残基的位置是基本一致的， 不同之处在于羧酸残基的位置。大多数日属于

10、a/折叠型水解酶。随着实验设备及技术的不 断提高改进，根据序列分析、定点突变和X.射线衍射等实验，研究者们发现了日的微观 结构，如图所示。EH由两个功能域组成：帽子结构和核心结构。帽子结构由五个螺旋组成， 其大小在5.59个残基之间，核心结构加末端到C末端，是由8个D折叠片组成的区域，其长 度在16.57个残基之间，具有一个催化性的三元组合，即：一个亲核性的天冬氨酸残基，一 个组氨酸残基和一个传递电荷的天冬氨酸残基。到目前为止，已有大量文献报道研究EH催化环氧化物水解开环生成相应二 醇的反应122刃1。其催化过程是通过酶与底物共价结合形成中间体而开环，如 黑曲霉EH，如图1. 3所示。催化反应

11、从共价结合的乙二醇.单酯.酶中间体开始。 首先位于酶帽子结构中的两个酪氨酸残基将环氧化物中的一个氧原子质子化，然后酶 的一个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成一个共价结合的中间 体，然后落入酶活性中心的一个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的 活化失去一个质子，形成一个羟基，该羟基进而进攻乙二醇一单酯.酶中间体， 酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。通过180标记实验，证实环氧化物水解 产生的二醇中的氧原子来自天冬氨酸残基，而非被夺取了质子的水分子。已报道的一种黑曲霉环氧化物水解酶的催化中心到目前为止，已有大量文献报道研究EH催化环氧化物水解开环生成相应 醇的反应。其催化过

12、程是通过酶与底物共价结合形成中间体而开环，如黑曲霉 EH,如图所示。催化反应从共价结合的乙二醇.单酯.酶中间体开始。首先位 于酶帽子结构中的两个酪氨酸残基将环氧化物中的一个氧原子质子化，然后酶的 一个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成一个共价结合的中间 体，然后落入酶活性中心的一个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的 活化失去一个质子，形成一个羟基，该羟基进而进攻乙二醇一单酯.酶中间体， 酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。通过七)标记实验，证实环氧化物 水解产生的二醇中的氧原子来自天冬氨酸残基，而非被夺取了质子的水分子。图1-3环氧化物水解酶的催化机理前面叙述了 EH拆分

13、外消旋环氧化物的两种机制，而并没有涉及EH在拆分 环氧化物时的位置和立体选择性问题。EH拆分环氧化物的实质是一个动力学拆 16分问题。可以理解为EH对外消旋体R和S之一的选择性更高，其被水解为二醇 的速度就快，二者水解速度的不同而达到分离尺和S的目的。之间涉及到一个 速度差的问题，即动力学拆分，如下所示：S-Lx RLY E：魄/昧 当昧大于砖时，说明外消旋体中R水解为二醇的速率大于S。E是对映体 比率，表示拆分的效率，其值越大，说明该酶的对映体选择性越强。在EH动力学拆分外消旋环氧化物，还涉及到一个手性中心构型改变的问题。根据上述EH的催化机制，环氧化物水解时有两条不同的途径，如下图1. 4

14、所 示Fig. 1-4 The two different hydrolyze approaches of epoxide hydrolaseR被活化的水分子进攻取代较少的手性碳原子时，生成的二醇其手性中 心构型保持不变；羟基进攻取代较多的手性碳原子时，产物二醇的手性中心构型发生翻 转。上述两种途径中，羟基都是以反式方式进攻的。只适用于环氧环中只有一个 手性碳原子的情况。若构成环氧环的两个碳原子都是手性分子，则无论羟基的进 攻方式如何，产物二醇中的两个碳原子的构型都将发生翻转。有报道，使用来自A. nige,.和Beauveria sulfurescens两种立体选择性互补的 环氧化物水解酶水

15、解苯乙烯环氧化物，结果得到了 ee值大于90%的R型对映体， 且实现了得率大于50% 251。四、应用早期的研究工作主要集中在哺乳动物细胞中的EH,但是由于哺乳动物的酶量少，来源有 限，制约了它的实际运用。随着微生物EH种类的增多，其应用方面的研究也逐渐增多。许多 学者使用高的底物浓度和不同的反应体系来扩大拆分外消旋环氧化物的规模。JustineDeregnaucourt等使用A. nigerEH拆分三氟甲基取代苯基环氧化物，采用两相反应体系(有机相 -水相体积比为1:5),底物-酶的质量比为58,底物浓度为360g/L (1.8mol/L), 4h后ee值可达到 99%。微生物EH催化生成的

16、有光学活性的环氧化物和二醇是有机合成的重要中间体。常用的催化 方式主要有三种:第一,采用单酶法。Daniel P. PienaarD等利用Yarrowia lipolyticaEH获得了许 多手性的羟基化杂环类化合物，如S-3-羟基四氢呋喃、S-N-苯基-3-羟基毗咯烷、S-N-苯基-3- 乙酰氧基毗咯烷等,它们是合成杂环类药物的重要前体物质。XinJia等使用Sphingomonassp. HXN-200 EH拆分3-氯乙烷、苯基环氧乙烷,生成的S-3-氯苯基环氧乙烷可以进一步合成 IGF-1R激酶抑制剂BMS-536924。这种拆分方式的不足在于产率不能超过50%。第二，采用 化学-酶法。Cleij等利用A.nigerEH拆分 4甲基-2-异丁基苯基环氧先得到S-环氧化物和R- 二醇,R-二醇用化学方法可以重新环化为消旋的环氧化物，然后继续拆分，有效地提高了产率。S-环氧化合物开环后，可进一步合成抗炎药物S-2-异丁基苯丙酸(布洛芬)，同时得到R-构型的 二醇，还可以环化为消旋的环氧化物,然后继续拆分，这样产物的循环利用有效地提高了产率。 第三,采用双酶法。Li Cao等利用两种选择性互补的酶(Solanum tubero