《动物传染病学（实验）》课件7 实验七 鸡的解剖病料处理和接种

1、实验七 鸡的解剖、病料处理和接种华中农业大学动物传染病教研室剖检在禽病诊断中的作用。掌握病禽剖检方法和程序。了解病料处理和接种的原则及程序。了解病原分离鉴定的方法。了解鸡胚的基本结构与功能及常用的鸡胚接种方法。一、实验目的二、疾病的诊断依据疾病的临床症状和病理变化进行初步诊断。对大多数传染病而言，确诊需要进行病原微生物的分离鉴定，是诊断的金标准。可以通过对组织、分泌物和拭子等样品进行适当处理后通过快速检测方法直接检测，也可以对病原微生物的分离纯化后通过血清学方法进行鉴定。鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。1.病料的涂

2、片染色、镜检：出败（巴氏）、大肠杆菌病。 2.病原分离和鉴定：细菌、霉形体、真菌可以在人工培养基上生长；病毒只能在活体动物、组织器官或细胞中生长繁殖。 3.血清学的检查：琼脂扩散试验、平板（试管）凝聚、免疫荧光、HA、HI、ELISA、病毒中和（VN）试验等。 特点：微量、准确、快速、自动化。 实验室诊断其它诊断方法 1.PCR、RT-PCR、核酸探针（杂交）、基因芯片等分子生物学手段。 2.物理化学分析：饲料成份检查，钙、磷、氟、怀疑毒物分析。 3.人工发病试验：用分离到的病原是否能复制出与临床病例相同的症状？ 主要诊断步骤包括病料的采集、保存和送检，病料涂片镜检，病原的分离与培养，对已分离

3、病原体的毒力和生物学特性的鉴定等。1. 病原学诊断 2. 血清学诊断 常用的血清学诊断方法包括血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验、中和试验、补体结合试验、酶联免疫试验、免疫荧光抗体技术，以及免疫放射技术等。可用已知的血清检验末知的病原、也可用已知的病原检验未知的血清，可根据需要和可能选择适当的方法进行检验（ELISA、HI和琼扩）。3. 分子生物学诊断 分子生物学诊断技术是20世纪七、八十年代发展起来的诊断方法，具有特异性强、敏感性和快速等优点，例如PCR、RFLP、核酸探针技术和基因序列分析等。可根据需要和条件选择合适的方法进行诊断。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）三、方法

4、与步骤3.1 细菌分离 无菌操作切取病变组织1-2g，涂于平皿的1/4区，然后用接种针分区涂开，置37温箱培养。3.2 病料处理（组织） 无菌操作取病变组织1-2g，用剪刀剪碎后移入匀浆器，加入5ml生理盐水用匀浆器研磨均匀。取出1ml研磨的悬液，加入到1.5ml的EP管中，1000rpm离心10min，取上清500l（加入双抗1-5%）。3.3 细胞单层接种 取分离的组织上清200l接种到培养好的单层细胞，并在细胞单层中加入抗生素以免细菌污染。置37温箱培养24-48h，观察有无细胞病变的出现。3.4 鸡胚接种 取分离的组织上清200l，根据疑似疾病选择不同日龄的鸡胚进行合适途径的接种，鸡胚

5、继续培养观察有无预期的鸡胚病变的出现。3.5 样品检测 对处理后拭子、分泌物和组织样品，可以用胶体金试纸条、ELISA、HA、HI、PCR或RT-PCR进行病原检测。1、卵壳 上有细孔，进行气体交换2、壳膜 使气体和液体分子在内外两方面进行交换。 鸡胚的结构与功能附：3、气室 呼吸和调节压力4、绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 5、尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。6、羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中7、卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。8、卵白

6、 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2、受精卵的壳最好是白色的3、受精卵必须新鲜，保存在5-20不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 受精卵的选择 孵育1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.52、相对湿度：50%-60%3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次 检卵 自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。 孵育4-5日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以

7、后胎动不明显，甚至无胎动。死胚：血管昏暗模糊，没有胚动 接种前处理1、用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。2、对鸡胚上将要接种的部位进行消毒（先用碘酊消毒再用酒精消毒）。 接种途径1、绒毛尿囊膜接种 （法氏囊）2、尿囊腔接种 （禽流感、新城疫）3、卵黄囊接种 （EDS-76）4、羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒 尿囊腔接种 主要用于正粘V和副粘V，如流感V、新城疫V的分离和增殖。1、选用9-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒3、用打孔器穿一小孔，将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接种物4、

8、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。 收毒 收毒前将鸡胚直立放置于4冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。 根据接种途径的不同，收获相应的材料1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml）3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体4、羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）四、结果观察和检测 24-48h后观察细胞病变。 细菌菌落形态，革兰氏染色，生化鉴定等。 收获鸡胚尿囊液，HA、HI或RT-PCR检测。鸡解剖实验材料发病鸡手套、酒精棉球、碘酒棉球剪刀、镊子托盘（鸡）、废液桶消毒液、肥皂塑料盆（血液、羽毛和离体组织）塑料桶（浸湿尸体和羽毛）实验方法外部检查采血处死和消毒打开胸腹腔暴露内脏记录病变1.外部检查精神状态羽毛、皮肤眼睛、眼结膜耳、鼻和口腔泄殖腔2.翼下静脉采血3. 处死和消毒口腔处死法: 将鸡的两翼和后肢保定，再将上下颌骨打开，然后用剪刀向沿腭骨深处剪下，就会剪断上颌动脉而致死；用消毒液浸湿尸体和羽毛。4. 打开胸腹腔股骨脱臼在腿腹间切开皮肤，用力握股骨向前、向下、再向外折去剪开皮肤通过胸骨的腹尖打开体腔剪开胸骨改变方向5. 暴露内脏取出肝脏、牵出肠道卵巢和输卵管心脏、肺脏和肾脏气管和喉头脑的暴露取出肝脏牵出肠道切开颅骨除去颅骨脑的暴露纵切脑组织取出脑组织五、结果与分析 记录观察到的病理变化，对可能的疾病