细胞与支架材料的相互作用

1、细胞与支架材料的相互作用相互作用：细胞在材料上的行为细胞与材料的黏附（Adhesion）；细胞在材料上扩展（Spreading）；细胞在材料上迁移（Migration）；细胞在材料上聚集（Aggregation）；细胞在材料上功能（Function）。细胞-材料黏附：细胞培养细胞在材料上的扩展在刺激因子的作用下，细胞骨架 微丝出现不对称分布；在细胞周边区域出现极化区；特异性的分子重排；导致细胞空间形态发生改变。细胞在材料上扩展的测量Cell morphology was visualized by differential interference contrast at the indica

2、ted times after cell attachment to substrate细胞在材料上的迁移组织工程中，细胞在材料表面或细胞间迁移，是 新组织形成或再生的必经阶段。细胞迁移过程是头部伸出伪足，附着于材料上， 后部黏附解聚，膜收缩，进而发生的前移。在复杂环境中细胞迁移很难测量。常用方法包括 细胞运动的个体化观测，或者大量细胞运动前沿 的测量。细胞的迁移过程在诱导因子作用下:前部伸出伪足;形成新的黏附位点;尾部与其它细胞断开并与基质脱附;细胞膜收缩;胞体向前移动。细胞迁移的测定细胞在材料上的聚集细胞聚集是研究组织发育的重要过程，与细胞 间的作用密切相关；组织工程中，细胞聚集为细胞-支

3、架复合物或重 构组织移植物增强细胞功能；细胞聚集程度用测量聚集体大小来量度；细胞聚集动力学通过测量聚集体大小随时间的 分布，用计算机图形分析获得。细胞聚集成团分散的红细胞聚集的红细胞细胞在材料上的功能在组织工程中，强调细胞的特定功能：肝细胞：分泌白蛋白和解毒功能；软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞：ECM、 防止反分化;成肌细胞：形成肌小管及收缩功能；干细胞：多向分化潜能、诱导分化。材料中细胞功能检测红色:孔隙黑色:支架材料 黄色:接种的细胞基质分泌 与检测主要内容细胞与材料的黏附作用(Adhesion)细胞黏附的意义测定方法影响因素举例:肌腱细胞与支架材料的黏附细胞与材料黏附的意义组织工程基本内

4、涵的体现：从单纯细胞、单纯 材料二者结合；组织工程研究的主要内容之一；黏附是细胞发生迁移、分化和增殖的基础；植入材料与机体发生作用的基础是细胞与材料 表面的黏附。细胞与材料表面的黏附至关重要细胞与细胞或基质的黏附细胞黏附与组织修复在诱导因子作用下，功能细胞迁移 并黏附于损伤区，然后分泌基质；血管内皮细胞迁移并黏附到损伤区;形成细胞外基质和血管系统。细胞与材料黏附的测定方法计数测定方法力学测定方法计数测定方法沉淀法（相差显微镜）荧光标记法染色法形态分类法细胞内酶(DNA)的含量计数法细胞悬液接种在材料表面，培养后 洗脱未黏附细胞，用显微镜计数，计算出 黏附细胞的百分比：rate N100%N 0

5、AdhesionN： 黏附的细胞数N0：接种细胞总数计数法优、缺点优点：简单快捷缺点：洗脱标准难掌握重复性差无可比性力学测定方法黏附力细胞与材料间形成黏附所需的力脱附力使已形成的细胞黏附产生破坏所需的力离心法Fa:细胞与材料的粘 附力R:细胞与转轴的距离:离心机角速度m:细胞质量FaCulture dishRotating axis2Fam R流室测定法方法在流室中，细胞受到流动液体的剪切力，同时 受到流室底面材料的黏附力。黏附细胞数量的改变， 给出细胞-材料相互作用的信息。显微镜密封胶载玻片入口出口带材料底面流室测定法计算公式细胞所受到的切应力： 6Qh2 w:培养液粘度;Q:流室流量;h:

6、 流室高度;w:流室宽度。hQ流室测定法细胞排列 0 0微吸管法Fa RpP2Fa：细胞与材料的 粘附力 Rp：微吸管内径 P：微吸管吸压Cell detatchment from surface polymerPolymerCellMicropipetteFocal adhesion细胞与材料黏附的影响因素细胞因素材料因素细胞因素细胞代谢状态：影响黏附与脱附；细胞接种时间：随接种时间增大而增大；细胞膜的疏水性：不同细胞有差异；细胞表面电荷：异性电荷有利于黏附；细胞的变形性：变形能力越强，黏附越易 发生。材料因素材料表面物理性质：浸润性(Wettability )、电荷 性（培养瓶经辉光放电或

7、酸处理）；材料表面化学性质：不同聚合物、不同基团及成 分吸附细胞数量及能力不同；材料表面修饰：裱衬(Coating)蛋白质、多肽、氨 基酸、生长因子等；材料表面形态：粗糙度(Roughness)及特化结构(Texture)。材料表面特性的影响不同聚合物具有不同的细胞黏附性；聚苯乙烯（PS）：黏附性聚合物；聚羟乙基丙烯酸甲酯（pHEMA） ：非黏附性聚 合物；用不同比例的PS和pHEMA获得不同的细胞黏附 性的基底。筛选材料时考虑其黏附特性表面物理特性的影响细胞在中等浸润性的表面上黏附较好；在正电荷表面细胞黏附增加；细胞培养基底常用辉光放电或酸处理增加表面的 带电基团数。比如：pHEMA 经酸处

8、理增加了细胞的黏附性；PS表面等离子喷涂促进细胞黏附。表面化学特性的影响表面血清存在有利于细胞黏附；化学基团（Chemical functionalities）：如- OH，-C-O影响细胞黏附；吸附蛋白质：如FN,LN等增加细胞黏附；表面化学修饰：共聚、接枝。特化的黏附细胞表面Hydrophobic (cell unfriendly) surface has been laid downover a hydrophilic surface through a mesh mask. This left a gridwork pattern ofhydrophilic surface, whic

9、h has been preferentially colonised by cells in culture.聚合物共混黏附表面The polymers differ only in the proportions of the two component blocks used:has a high density of cells, whilehas no adherent cells.ABABA:亲水性聚 合物;B:疏水性聚 合物.聚合物的降解性降解性聚合物为细胞黏附提供了动态基质组织工程支架的要求;PLA，PGA，PLGA是常用的降解性聚合 物，利于细胞黏附并经FDA认可；细胞介导的

10、聚合物降解机制Synthetic peptides may be incorporated into materials to facilitate : controlled degradation via cell mediated enzymaticdegradation材料表面修饰(Surface modification )预涂纯化的黏附分子，促进细胞黏附；预涂黏附分子抑制剂，抑制细胞黏附；表面固定胶原及其它胞外基质分子；表面固定生物活性功能基团，短肽链或氨基 酸序列等，提高非(弱)黏附表面的特性；固定氨基酸、糖类等碳水化合物促进细胞黏 附。材料表面结构的影响材料表面形态结构（纤维、多

11、 孔）；材料表面微结构（微米、纳 米）；表面粗糙结构（含沟、槽）；表面凹凸结构（含峰、谷）；表面特化结构（黏附区、非黏附 区）。材料物理状态对细胞的影响拉力细胞生物材料牵拉表面对细胞粘附的影响肌腱细胞+硅胶膜： 二维动态培养ABA: non-stretchB: stretch牵拉表面对细胞功能的影响细胞与材料黏附分类非特异性黏附(Non-specific adhesion) ： 由细胞和材料表面物理性质决定特异性黏附(Specific adhesion)：由细胞 和材料表面分子间的特异相互作用决定 (Specific adhesion forces at molecular contact)黏

12、附力的类型非特异性黏附力：范德瓦尔斯（Van der Waals）力静电作用力其它物理作用力 特异性黏附力：受体-配体相互作用力范德瓦尔斯力分子的空间位置或运动与其它分子的 空间位置或运动相互关联而产生的 力，其大小与r-6成正比。静电作用力(electrostatic interactions)同种电荷产生相互排 斥力(repulsive)；异种电荷产生相互吸 引力(attractive)。其大小与电荷量及二者间距有关qqeF K 12r 2rq1q2Fe受体-配体相互作用钥匙 与 锁 的 作 用受体-配体相互作用：综合作用非共价的；几何形状匹配的；许多弱相互作用；取决于受体和配体的距离、角

13、度和位形(Conformation)；距离合适，若角度和位形不匹配，会“视而不见”。整合素蛋白受体 ：介导黏附细胞-材料特异相互作用是基于连接于材料表面 的黏附蛋白（作为配体）与细胞表面的整合素蛋 白(integrin)（作为受体）间的特异性黏附；这种受体-配体间的特异性相互作用可通过人工 合成多肽或蛋白质在体外进行模拟。短链多肽典型的氨基酸三肽链精氨酸-甘氨酸-天冬 氨酸序列Arg-Gly-Asp (RGD) ；RGD在很多胞外基质黏附蛋白活性链中存 在（CN，FN）；与整合素蛋白(Integrin)受体特异性结合。RGD介导的粘附Synthetic peptides may be inco

14、rporated into materials to facilitate cell attachment through specific ligands.胞外基质蛋白（ECM）细胞对胞外基质蛋白，如纤维粘连蛋白（Fibronectin，FN) 和层粘连蛋白（ Laminin ，LN)的黏附，主要由整合素 蛋白质(Integrin)受体介导；整合素蛋白质受体介导的细胞黏附，是受 体激活和力学耦合到胞外基质配体上的高 度调节过程。抗黏附作用阻断或者竞争性吸附材料表面的配体，或 者细胞表面的受体，可有效地抑制细胞与 材料的特异性黏附；设计材料表面特化区域；设计医用植入材料，用于防止组织粘连。 腹

15、壁和肌腱修复中防粘连。FN和胶原介导的黏附特异性细胞反应植入物表面与细胞或蛋白质发生的特异性相 互作用；在设计材料时在其表面进行分子设计，可以 促进植入物与机体组织发生特异性黏附；这种设计可极大地促进植入材料与细胞间发 生的界面结合能力。这在骨科和牙科植入体提前负重有重要意义。举例肌腱细胞与支架材料的黏附Cells and MaterialsHuman embryonic tenocytes (HETCs）Transformed human embryonic tenocytes(THETCs）Poly-D-lysine (PDL）Bovine serum albumin (BSA)Type

16、I collagen (CNI) and its Antibody (a-CNI)Fibronectin ( FN）and its Antibody (a-FN)材料表面处理方法PLGA溶于丙酮；均匀涂抹于载玻片上；冻干；表面孵育PDL或BSA；依次孵育不同浓度FN或胶原；依次孵育不同滴度FN或胶原抗体；孵育不同浓度类胰岛素生长因子。聚合物膜厚度测量Polylactic acid (PLA) :18.6 mPolylactic-co-glycolicacid (PLGA): 17.3 mSurface of PolymersABCEDF细胞培养及黏附力测定Cell culturecell co

17、llectionCell seedingIncubation(37,5%CO2,30min)Micropipette aspiration techniqueExperimental apparatusAdhesion Force MeasurementCalculation of adhesion forceR： internal radius of micropipetteP：aspiration pressure of micropipetteap2F RP细胞脱附过程接种时间的影响012354306090120150180Seeding time(minute)Adhesion for

18、ce(10-8N)HETCs+PLGAHETCs+PLGA+FN(2.0g/ml) THETCs+PLGA THETCs+PLGA+FN(2.0g/ml)Comparison ofPLA to PLGA*and*represent statically significant differences inside and between groups , respectively（P0.05）, n is number of cellsn=36*n=52n=36*n=40*n=43*n=28*876543210PLAPLGA85/15Adhesive force(10 -8N)Polymer(PLA or PLGA85/15)(control) Polymer+BSA(50g/ml) Polymer+PDL(2g/ml)型胶原对腱细胞黏附的影响0246010125CNI concentration(g/ml)Adhesion f