免疫荧光染色方法介绍

1、细胞免疫荧光-多重染色1.原理介绍我们现在来考虑一下多重染色。使用多个标签进行免疫染色的目的，是在同一细胞或 组织切片里，同时对两个或多个抗原进行染色定位。各个抗原分别使用不同的标签，以便 区分。抗原可以是共定位的，即它们的亚细胞定位一致，或者是分开的。荧光的作用原理。荧光分子能吸收特定波长的光，然后发射更长波长的光。在发出荧 光之前，荧光分子跟环境相互作用失去能量，从而达到这一目的，这一现象叫内转换。电子可以是基态或静止态S0，也可以是较高能量的激发态S1和S2。在每一个电子 态，荧光染料存在的振动能级可以有多种，包括0级、1级和2级。室温下，能量不足以 使电子激发到激发态S1和S2或基态的

2、较高振动能级。所以，只有当光存在时，吸收才 发生在振动能态最低的分子上。荧光染料在吸收光后，通常被激发至一个较高的振动能级S1或S2，然后再回到S1 的最低振动能级，从而完成内转换过程。此过程与光子发射过程结合形成荧光。荧光染料 可多次重复这一激发发射循环，直至荧光消失，也就是光漂白。相较而言，有些荧光素更 容易发生光漂白。例如，FITC重复激发发射循环约30000次后发生光漂白。而第二代荧 光染料，如Alexa Fluor系列的光漂白没有这么快，由于它们有较高的消光系数，比较明 亮，更适合用于多标记实验，如本幻灯片图像所示常用到的一种传统染料的组合是：DAPI蓝色染料、FITC绿色染料、TR

3、ITC黄色染料 和Cy5红色染料。而相应的第二代染料组合是：DAPI蓝色染料、Alexa Fluor 488绿 色染料、Alexa Fluor 555黄色染料和Alexa Fluor 647红色染料设计荧光多重标记实验时，可以采取以下几个步骤，以最大限度的减小或消除串色现 象。首先，分析待选荧光素的吸收光谱和发射光谱，结合显微镜滤光片组的特点，评估是 否兼容。尽量选择发射带宽窄的荧光素，以最大限度的减小与其它荧光素光谱的重叠。使 用最明亮的荧光素来标记表达丰度最低的蛋白。如果蛋白的丰度相近，则适当降低波长最 短的荧光素的使用浓度，从而减小到较长波长荧光素的串色程度。仔细选择显微镜的滤光 片组，

4、尽可能的匹配每种荧光素的吸收光谱和发射光谱。调整显微镜的曝光，增益与减光镜设置，微调过强的荧光信号。最后，在多重染色之 前，分别进行单染预实验，使用其它滤光片来观察评估串色问题。并根据上述参数调整实 验设计。2.方法现在让我们来讨论多重染色技术。简言之，多重染色实验是同时使用两个或多个标签 的染色技术。多重染色方案以本次讲座前半部分为基础，必要时加上孵育和清洗步骤。无论何种情况，都强烈推荐使用预吸附的二抗，有助于尽可能的减少交叉反应。在多重标记实验中，强烈建议先单独优化每种单标记的实验条件，然后才将它们组合起来主要关注 点是怎样避免每一检测体系的单个成分之间发生交叉反应多重染色技术可分为两种方

5、法：同步法，一抗同时孵育；逐步法，一个单标记染色技术做 完后再做另一个。首先我们来看同步染色。如果一抗来源的种属之间差异足够大，那么它们可以同时孵育。 小鼠来源和兔来源的一抗组合，差异足够大，而小鼠来源和大鼠来源的一抗组合则不然。 其次，如果二抗的种属来源相同，可以同时孵育。如果抗体是直标一抗，即一抗上直接偶 联不同的标记物，那么哪怕抗体的宿主来源相近甚至相同，也可以做到同步染色。当然， 前提是抗原的表达丰度高，要求的信号放大程度低。如果抗体来源于同一物种，但是同种 型不同，那么使用针对相应同种型的二抗，也可以进行同步染色。大家可以看出，在同步 染色中，我们能做的很有限，尤其是在信号放大方面，

6、相较而言，这方面逐步染色更有优 势。比起同步染色，逐步染色灵活得多，对于低丰度的抗原，可以进行额外的信号放大，而不 仅仅是使用二抗。对于丰度最低的抗原，应使用最灵敏的检测体系。需特别注意试剂的添 加顺序。举个例子，三个均源于小鼠的一抗：一个是荧光素直标一抗，一个生物素直标一 抗，一个是非直标一抗。第一步：将样本与非直标小鼠一抗一起孵育。第二步：将样本与荧光素标记二抗一起孵育，如山羊抗小鼠二抗。第三步，将样本与小鼠血清一起孵育，确保山羊抗小鼠二抗被封闭。第四步：将样本与生物素化小鼠一抗一起孵育。第五步：将样本与荧光素偶联ABC复合物一起孵育。最后第六步：将样本与荧光素直标小鼠抗体一起孵育。这就是

7、三重染色，而试剂之间不会发生交叉反应。还请注意，以上的每一步骤之间，需要 用缓冲液漂洗。使用同一种属来源的抗体时，另一个方法是增加桥接抗体。举个例子，两个小鼠来源的一 抗：一个非直标抗体，另一个是HRP直标一抗。第一步：将样本与非直标一抗一起孵育。第二步：将样本与荧光素标记二抗一起孵育，如山羊抗小鼠二抗。第三步，将样本与小鼠血清一起孵育，确保山羊抗小鼠二抗被封闭。第四步：将样本与HRP直标一抗一起孵育。第五步：将样本与抗HRP的抗体（如兔抗）一起孵育。最后第六步：将样本与荧光素偶联山羊抗兔抗体一起孵育。第二种也可以换用生物素化的抗体和ABC体系。同样，还请注意，以上各步骤之间，需 用缓冲液漂洗

8、。最后，让我们考虑一下多重免疫染色时必须使用的对照组。对照组是非常必要的，用于验 证染色结果是否真实，而不是根据检测体系或样本特性。由于多重染色是两个或多个单标 记染色技术的组合，每一检测体系所需的试剂对照数量相当庞大。考虑到时间限制，至少 要完成以下对照组。首先是阳性对照，针对各个一抗。然后是阴性对照，针对每一检测体 系，分别实施无一抗对照。我的讲座差不多该结束了，但是关于多重染色，如果别的都忘了，那么请记住以下内容。 只要在实验设计上多花功夫，可用的染色组合非常多。选择发射光谱不重叠的荧光素，并 匹配显微镜的滤光片。认真考虑各种可供选择的检测体系、潜在的交叉反应以及试剂添加 顺序。最后，一

9、定使用适当的对照，并单独对每一个染色进行预实验，以便优化各个试剂 的浓度并评估可能的串色。一般来说，多重免疫荧光染色实验中二抗的选择条件比较多：1，要使用间接标记的荧光抗体1）应用范围广；2）直接标记的一抗经过纯化后标记，拥有干净的背景，适用于多染，但在IF多染实验的实 际应用中很有限，且身披不菲的价格，对个人的实验条件有一定限制。2，二抗种属来源需相同这是为防止不同种属来源的二抗发生交叉反应以及生成较高的背景一一若一抗A、B种属 分别为 Rat、Rabbit，那么二抗的种属必须为 donkey anti-Rat、donkey anti-Rabbit 或 goat anti-Rat、goat anti-Rabbit等。3，要选择预吸附的二抗普通荧光二抗有可能与内源性的免疫球蛋白发生相互作用，而预吸附的二抗则可以降低这 种情况的发生，从而提供很低的背景。4,二抗荧光颜色尽量差异大若选用荧光相近的粉色和粉红或青绿和绿色则很有可能面临拍出来的图片存在串色的