碱裂法提取DNA

1、题目：阳性克隆菌落PCR鉴定及荧光蛋白基因的原核表达一、实验目的1、菌落PCR鉴定阳性克隆2、重组质粒的提取（用质粒提取试剂盒）3、重组质粒的转化二、实验原理PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性一退火一延伸三个步骤组成：高温变性-94c下DNA双链解旋为单链；低温退火-55 C左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结 合；中温延伸-72 c时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5一方向，复制模板的互补链。按此循环（变性一复性一延伸），一般重复2530次，短时间内，使目的基 因片段扩增2n （n代表循环次数）。三、实验材料、试剂及用品1、材料：DN

2、A模板，4 X dNTP, T7正反引物 （分别标记为引物1和引物2）, Taq酶，琼脂糖， Marker DNA ,吸头2、试剂:10 buffer（内含有 MgCl2）T7 启动子正向引物：5-taa tac gac tca cta tag gg-3T7 启动子反向引物：5-tgc tag tta ttg ctc agc gg-33、仪器：PCR热循环仪， 琼脂糖凝胶电泳系统四、方法和步骤（一）阳性克隆菌落 PCR鉴定1、在0.2mL EP管内配制25 dL PC阪应体系1个:反应物体枳（UL）ddH2020n10 XBuffer2.5KgC124X dNTP1引物10. 5引物20.5T

3、aqlW0. 5菌落挑一个2、用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心。3、放入PCR仪中，设置反应程序：94 预变性5min ;94 C变性30S;55 C退火30S;72 C延伸60S; 重复步骤30次；72 C延伸10min。4、取5L反应液加1L 6 x loading Buffer电泳检测，分析所得目的片段的大小。（二）pET-28a-EGFP的原核表达1、用试剂盒提取质粒（菌液和试剂盒均放于最后一排，溶液1用完需放回冰盒中）。操作步舞.用前请先在冰洗液PW中加入无水乙加入体积请参照瓶上的标签*1柱平衡步骤：向吸附柱CP3中L吸附柱放入收集旅中 加入500 3的平衡液耳匚12。0

4、0/Pm 13序X）xg）两心1 Em倒疝K篥管中的废液.将吸附柱直新放回收总管中整建过的柱子O2,取1.5 ml过夜培养的菌液.加入高心管中，使用常规台式通心机，12,。0 rpm Ll3,400Xg ）离心1 ER,尽量吸除上清函液较多时可以通过与次圈心将圜体沉淀收集 到一个瓯心管中）.3向蔺有蔺体沉淀的高心篱中加入2503溶液P1请先检查学否已翘入RNase A ，使用移 液箱或涡旋振聿器彻底悬浮细西玩徒.注ML如果有未抑底混药的网块.会的晌裂解.导致摄取,和究度儡低4.向陶心管中加入25口川溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解注意：温和地混合.不宴剧则震篇，曝免打甑基因组DM

5、A,造成展取的质粒中赛有基因铝ONA片断此时函液应变得清身拈耦，所用时间不应超过5 m以免质粒受到就坏 如果未唾网演完.可Kt由于!体过春，毁解不砌麻，成总少苗体量5,向离心管中加入35。川溶液P3,立即温和地上下翻转。用次，充分混匀，此时将出现白色 裁状沉淀.12.000 rpm 13,400 xg ）离心 1。mln.注意:户3加入后应立即混合，潮丸产生局部沉淀 如果上演中迁前微小白色沉淀,可再 次离心后取上清口将上一绅收集的上清液用移液器转挈到吸附柱CP3中（嗯相桂放入收与畦中），注意展 不要嘿出沉淀.1算。00 rpm （-134。xg）同心3。-6。sec,倒掉收集管中的废液.将吸

6、的柱GP3放入收集管中*可选步ar 同股州杜c尸3中加入58 山去与白法尸口. iz。中小 仔侬狼口*）高心3。 60 sec-倒掉收，管中的废液,将吸附柱CP3K新放回收集管中加耶市生而是日M段海生向rTGT, SL2h HB101, JM系列,ET12567）.这鹭有 主塞含有大的核酸整.舄降解旗粒DNM推特采用此步.加果宿主函是的附宿主豳tDHScr, TOPW） r这步可备略&向吸附柱CP3中加入go 3漂洗液PW里包查遢查旦旭A锤乙电% （7&400、g网心30七Osg倒掉收集管中的废液，将吸附柱匕困放入收集首中.9重复操作步骤乩将吸附柱CP3放入收集管中.12,000 rpm （-

7、13,40 xg）离心2 mid目的是将吸附柱中 余的漂洗液去除一注意：漂洗液中乙国的残国会帔响后续的晶反应C酶切、PCR等）实脸，为确保下游 轴不受残留乙II的叁响.建议将啜附柱CP3开篇于室温放.数分钟，以彻底晾干 附材料中残余的漂洗液.11.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100川洗脱缓冲上 EB,室温放置2 Ein. 12,000 rpm卜1340。xg）南心2 min将质粒溶液收集到离心管中 注意：洗脱襄冲液体积不成少于503，体积过小影响回收效串,洗脱液的pH值对于烹 脱故率有很大影响若后续做泅序.II使用dd0做洗脱液.并保证其pH值在7.0-&

8、5y 圉内，pH值低于7.0会降低洗脱效率且DNA产物应保存在.20七，以防DNA降解,为一 增加质莅的回收密，可簿得到的溶液重新加入吸附柱中.京温放置2 min. 12.000 rpr （-13,400Xg）离心2 min,将质粒溶液收集到离心管中,2、取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每100dL解冻的感受态细胞加入10 dLpET-28a-EGFP质粒，混匀后冰浴30min。3、42摄氏度热冲击90秒，立即置于冰浴 5min。4、再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基，于37摄氏度摇床中培养 1h。期间将100的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上（两个

9、人共用一个平板， 每人涂100pLIPTG）, 待用。5、1h后，6000r/min离心5min ,去掉上清（约留 100 口培养液），摇匀。6、用玻璃涂布器（记得冷却）将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37摄氏度培养箱中倒置培养皿过夜。培养结束后，放4c冰箱保存。下一周观察结果。五、实验结果:重组DNA分子的转化实验的实验结果:图一：重组DNA分子的转化实验结果由图可见，我们小组并没有在上一次的实验的平板上长出菌落，所以此次的实验我们 借用了其他小组的平板上的菌落来进行 PC蟋定实验。图二，PCR后的电泳鉴定图泳道1为DL2k marker, 5条带

10、的长度由上往下分别为 2000bp,1000bp,750bp, 500bp, 250bp, 100bp,其中 750bp带最亮。2号是老师的对照，3号和4号泳道是我们所得的实验结果。2号对照在2000bp至1000bp之间有一条条带，在1000bp至750Bp至今有一条条 带。3号和4号在底部的RNA勺亮度比2号的要亮的多，4号在250bp下有一条 条带。（二）pET-28a-EGFP 的原核表达：图三，一个星期后的平板上菌落的生长情况左边为黄智泓同学所涂的平板，平板左上角上可见许多黄绿色菌落，即转入绿色 荧光蛋白基因的菌落.下面部分是小的白色透明菌落。而右边是我的所涂抹的版块。 在菌落数量上

11、远少于左边，而且并没有出现绿色菌落。除了有小白色菌落外，在中间 还有一个比较大的白色菌落。七、实验讨论：（一）分析电泳结果，转入绿色荧光蛋白的大肠杆菌 DNA的3号和5号泳道最 亮的条带是1000bp上方的亮带，下方的可能只是空载体。即原来的质粒环，没有经 过限制酶剪切和连接酶连接。3、4号并没有在的亮带。原因分析：.大肠杆菌没有转入重组质粒。.可能是长时间抗生素失效，而引起的菌落长出。我们小组实验失败的分析如下：我认为是涂平版时涂布器没有冷却就进行了涂布，导致导致受冷浴又受热冲击的 脆弱的感受态细胞死亡。（从两次涂平板的结果可以看出，第一次没有过多注意冷却的问题，导致无菌落长出，第二次右边我

12、冷却了一会进行涂布，但也时间较短(二)从平板的结果来看：1、可以看到大肠杆菌菌落只在平板边缘生长，分析原因：(1)涂布菌液的时候，涂布棒把菌液推到了平板边缘，没有均匀涂布。(2)放置平板的时候，平面并不水平，从而导致菌液流向平板边缘。(3)没有待涂布棒完全冷却，便进行涂布菌液。由于是先将涂布棒放到平板中央，所以平板中央的大肠杆菌被烧死。之后已经在平板上冷却的涂布棒将剩余菌液涂布到平板边缘，所以有活力的菌液只在平板边缘生长。2、观察图3,发现转入绿色荧光蛋白的大肠杆菌的菌落比其他大多数白色菌落大的原因是：(1)由于平板培养基含有抗生素的原因导入绿色荧光蛋白的重组质粒的大肠杆菌生长速度大于其余大肠

13、杆菌。(2)随着抗生素的失活杂菌与还没有转入得菌落生长迟。还发现了比较大的白色菌落，应该是突变的可以在加了抗生素的培养基上生长思考题：. PCR-般循环重复2530次，重复次数过多会怎样？循环数太多了，虽然可以一定程度的提高产物量，但是由于反应时间过长， 有一些非特异产物的扩增也会相应增加，而且随着酶的扩增能力下降，合成 目标片段的能力也会随之下降，也可能引起其他的非特异扩增。dNTP也会消耗，如果有某一种dNTP消耗比较大，后续扩增就难免会引起错配，反而会造 成不必要的麻烦。.再复习一下Taq DNA聚合酶的特性和菌落PCR的原理。1)温度越高,Taq酶的合成速率越高。温度过高(90 C以上)或过低(22 C)都 可影响Taq DNA合酶的活性。2)由于菌落是由一个细胞繁殖而来的，所以菌落 PCR(ColonyPCR可不必 提取目的基因DNA不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的 DNA为模 板进行PCFT增。. PCRS程中的几个温度根据什么来设置的？持续时间是否可变？基于PCRI理（DN敬链变性和退火以及taq酶的活性）而设置变性-退火- 延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法， 双链DNA& 9095c变性，再迅速冷却至4 060C,