人民医院基因扩增试验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序

1、人民医院基因扩增实验室 EB病毒核酸定量检测标准操作程序项目名称单纯疱疹病毒n型核酸定量检测检验方法名称TaqMan荧光定量检测方法学原理用一对EB病毒特异性引物和一条 EB病毒特异性荧光探针， 该探针为一寡核甘酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q） o探针完整时，R基团发射的荧光信号被 Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5 -3外切酶活性将探针 酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团 的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到 R基团的荧光信 号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生 的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了

2、荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据 PCR反应液的荧 光强度即可计算出初始模板的数量。标本要求适用标本类型：全血。标本采集a ）全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）或枸檬酸钠抗凝剂的玻 璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合510次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。试齐1J试剂名称：EB病毒病毒核酸定量检测试剂盒 （PCR-荧光 探针法）生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；试剂货号：#DA-B065 ;包装规格：20人份/盒；试剂成份：组成部分数量DNA提取液（500山管）2管CT PCR反应液（400山管）2管Taq酶（601管）

3、1管EBV阴性质控品（150山管）1管EBV强阳性质控品（200”管）1管EBV临界阳性质控品（200山管）1管EBV阳性定量参考品（1.0X104基因拷贝/ml）101管1管EBV阳性定量参考品（1.0X105基因拷贝/ml）1管组成部分数量101管EBV阳性定量参考品（1.0X106基因拷贝/ml）101管1管EBV阳性定量参考品（1.0X107基因拷贝/ml）101管1管5.6 试剂储存条件：保存于一20 C,有效期6个月仪器ABI 7500全自动基因扩增检测仪操作步骤DNA提取阴性质控品处理a ）取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50皿 至0.5ml 灭菌离心管中，加入 50

4、 H l DNAI取液充分混匀，100。恒 温处理10 1分钟；b ） 12000r/min 离心 5min,备用。标本处理全血a ）取全血1ml至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1ml轻摇混 匀；b ）取干燥玻璃试管卷入500 d淋巴细胞分离液;c ）将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液 的试管中（注意沿管壁，速度要慢）；d ） 2000rpm 离心 20min ；e ）吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1.5ml离心管， 12000rpm离心5分钟；12,000 rpm离心5分钟；f ）去上清，沉淀中加入 50DNA提取液充分混匀，100c 恒温处理101分钟；g ） 1200

5、0r/min 离心 5min,备用。EBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）；EBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；EBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用；PCR扩增试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（EBV PCR反 应液40川人份+ Taq酶3川人份）取相应量的 PCR反应液及Taq 酶，充分混匀后按43山管分装至0.2ml离心管中备用。加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理 后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质 控品）上清液2小 或直接加入阳性定量参考品 2口，8000rpm离 心数秒，放入仪器样品槽。设置PCR循环扩增程序如下93

6、C 2分钟预变性；10个循93 C 45 秒55 C 60 秒93 C 30 秒55 C 45 秒30个循结果判断：如果增长曲线不呈 S型或Ct值=30,则实验结果判为样 品的HSVII DNA总含量小于检测下限。如果增长曲线呈S型曲线且Ct值30,则：a ）若样品的C5.00E+003,贝U该样品的EBV DNA 总含量5.0 x 103基因拷贝/ml；b ）若样品的 5.00E+003&CW5.00E+007,则该样品的 EBV DNA总含量=C基因拷贝/ml;c ）若样品的C5.00E+007,贝，该样品的EBV DNA 总含量5.0 X107因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取

7、后的 样品稀释至线性范围内再检测。质控a ）阴性质控品：增长曲线不呈 S型曲线或Ct值=30;b ）阳性质控品：增长曲线呈 S型曲线，且强阳性质控品定量 参考值在1X106因拷贝/ml2x107因拷贝/ml范围，临界 阳性质控品定量参考值在 2X 102基因拷贝/ml2 x 104基因 拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）；c ）阳性定量参考品：增长曲线不呈 S型曲线，Ct值27,且 线性相关系数0.97|r|1;d ）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无 效，需重新进行。参考范围低于检测下限性能指标灵敏度:5.0X 103基因拷贝/ml线性范围：5.0X 103

8、基因拷贝/ml5.0 x 107基因拷贝/ml临床意义早期诊断：对于EB病毒急性感染如传染性单核细胞增多症， 最早出现于临床标本中的是病原体本身，采用高灵敏度高特异性的实时荧光PCR方法进行检测，可以在感染的早期明确病因。鼻咽癌的监测治疗：鼻咽癌具有对放疗敏感， 易复发和远处转移等特点。虽放疗为鼻咽癌的首选治疗方法， 但其仍有部分患 者出现远处转移和局部复发导致失败。在临床上，常会以常规体检、纤维镜、胸片等作为鼻咽癌患者复发转移的监测手段，但是这些方法要么缺乏一定的特异性，要么缺乏一定的敏感性，难以及时发现并实施早期治疗，且不能区分原发和转移癌。因此，采 用实时荧光PCR直接定量测定血液中 E

9、B病毒DNA,则可以及 时准确的反映其在患者体内的消长情况，作为鼻咽癌治疗预后， 转移和复发的监测指标。EB病毒属于疱疹病毒，可引起增殖性感染和非增殖性感染。 特别是非增殖性感染，可导致细胞癌变。被认为与传染性单核细 胞增多症。淋巴癌、胃咽癌、何杰金氏癌、慢性疲劳综合症有关注意事项实验室管理应严格按照 PCR基因扩增实验室的管理规 范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂 准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后 一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区 各阶段用品不能交叉使用；为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手

10、套，使用自卸管移液器；对每次实验进行质量控制；试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；自备灭菌生理盐水；标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用 加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截;为保证病原体颗粒充分裂解可转至4c静置68小时；标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，弁与废弃物一起灭菌后方可丢弃；实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作 台和移液器；所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均 需符合相关法规要求：卫生部微生物生物医学实验室生物安全 通用准则和医疗废物管理条例。参考文