生命起源与进化：09蛋白质的分子进化及抗体库技术

1、蛋白质的分子进化DNA Shuffling技术抗体库技术 第九章 蛋白质的分子进化及抗体库技术 1 蛋白质的分子进化基因的直接进化蛋白质分子进化的基本步骤蛋白质分子进化的用途从自然界中筛选人工诱变诱变对象是生物体，本质上是生物基因组的诱变蛋白质工程在分子水平上，对蛋白质改性。如何获得新的蛋白质、提高酶的活性？（从头设计：完全根据现有知识）蛋白质工程的三个基本策略（理性设计：根据酶的3D结构）（分子进化：是一种人工加速的随机突变过程）基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题基因直接进化的用途提高酶活

2、性天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍改变底物特异性和对映异构体选择性酯酶可水解非天然酯类改善酶的工艺性冷适应和热适应酶改变酶的拓扑结构二体酶变为单体酶获取许多新的理论知识部分研究成果类 型示 例特 性活性增加倍数潜在应用领域蛋 白绿色荧光蛋白荧光强度45基础研究重组蛋白RecA重组率100基础研究抗 体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药 -内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞

3、代谢途径汞解毒12生物制药TLPs（同序植酸酶 ） 的失活曲线亲代真菌植酸酶的最适温度为45-55，而同序植酸酶的最适温度为71，增加了16-26。TLP-ste突变蛋白的三维结构酶拓扑结构的变化建立基因突变库；蛋白质结构/功能的展示；筛选；基本步骤：建立新库许多蛋白具有共同架构；蛋白质间的相互作用界面具有柔性；蛋白质间的相互作用具有关键位点。展示蛋白架构环肽抗体细菌受体DNA结合蛋白蛋白酶抑止剂缩微蛋白随机突变（随机合成）点突变定向突变体外的基因突变 2 DNA Shuffling技术DNA Shuffling机理易错PCR法交错延伸(StEP)技术Family Shufflingss-DN

4、A Shuffling双链DNA内切酶ITCHY技术外显子改组Genome Shuffling项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组高DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组低DNA Shuffling与常规定向进化的比较Flash Play PCR示意图95变性55退火72延伸2030次循环无引物PCR克隆单个基因酶解成小片段有引物PCR纯化取30100得突变基因PCR循环数增加产物长度增加易错PCR法(Error-prone PCR) 降低一种dNTP的量（降至5-10） 加入dITP(脱氧肌苷酸)来代替被减少的

5、dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+易错PCR 随机引物PCR和重组装交错延伸(Stagger extension Process, StEP)在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间,从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行,直到产生完整的基因长度,结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。此方法省去了DNA酶切割成片段这一步,因而简化了DNA改组的方法。交错延伸PCR突变法Family Shuffling当DNA Shuffling用来改组一系列进化上相关的基因时,就称为Fami

6、ly Shuffling,此方法中的DNA基因之间要求有一定程度的同源性,一般要求为70%以上。另外,因为是多个相关基因的改组,可以获得高质量的酶的多样性库。采用Family Shuffling进行基因改组已成为DNA改组的主要方法。ss-DNA Shuffling一般使用ds-DNA做模板,形成的有效重组机率非常低。ss-DNA Shuffling就是单链DNA做模板进行Shuffling。为了提高Family Shuffling时的嵌合率,通过ds-DNA和ss-DNA进行Shuffling,结果显示ds-DNA的嵌合基因率低于1%;而ss-DNA嵌合率高达14%,且利用ss-DNA为模板

7、得到的嵌合基因所编码的蛋白热稳定性更好。经典的DNA ShufflingDNA单链的DNA Shuffling双链DNA内切酶：55由于DNA链的延伸只能是按53方向进行：第一和第四种分别为自身重退火，第三种为5端退火，这三种均不能延伸。只有第二种是正确的3端退火，得以延伸而形成杂合分子经典单链双链内切酶杂合分子形成的比例ITCHY技术(Incremental trunction for creation of hybrid enzymes)为了解决不能用于改组同源性低于70%-80%的序列,使得同源性低的序列、甚至非同源性序列间也可以发生重排。即先将两个相关酶基因经单酶切打开一个切口,目的是

8、给外切酶Exo提供作用位点。Exo每隔一定时间如30s取一次样、灭活。然后将两基因的酶解产物混合,平端连接,即可生成ITCHY库,ITCHY库实际上是产生多样性库的一种手段。基因2ABABABexoexoABABABblunt endsDNA shuffling ITCHY基因1单酶切打开一个切口（基因1在B、基因2在A处切开）目的是给外切酶ExoIII提供作用位点。ExoIII每隔一定时间如30秒取一次样、灭活。然后基因1和基因2的酶解产物混合，平端连接，即可生成itchy库，再用经典的DNA shuffling处理。Itchy实际上是产生多样性库的一种手段。基因1基因2当两个基因之间无同源

9、性时使用这种方法！核酸外切酶 III (E.coli)从3-OH端水解单链。它只能作用于双链DNA的以下部位：平端、5-端突出、内部切口，而不能作用于突出超过4个碱基的3-OH端（突出）平端5-端突出内部切口（nick)In vitro exon shuffling. In this format, domain-encoding exons (or exon sets) of the target gene and homologs from other, related genes, are amplified using chimeric oligonucleotides. In the

10、 next step, these pre-made DNA fragments are used as both primers and templates in a PCR-like reaction that reassembles the full-length gene. The final step involves the screening of the exonshuffling library for desirable functions or properties.外显子改组（exon shuffling)Genome Shuffling就是与传统的进化技术相结合如原生

11、质体融合技术,对整个基因组进行Shuffling,不是对一个或几个基因的改组而是对所有基因的改组,与传统的育种技术相比,它可以对每代的多个亲本进行改组,genome Shuffling的改组大大地增加了可改组的空间,可将多个原基因的有益基因杂合在一起。 3 抗体库技术免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的基因结构免疫球蛋白的基因重排抗体分子的人源化改造小分子抗体抗体库的构建抗体基因表达宿主免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的基本结构CLCLCH1VLVLVHVHCH2CH3C端N端恒定区可变区FC 段Fab段铰链区补体结合Fc受体结合抗原结合部位1、重链和轻链 Ig的两条长链称为重链（Heavy chain,

12、H链） 重链可分为、链 Ig的两条短链称为轻链（Light chain, L链） 可分为、型。每个Ig分子的两条轻链完全相同。 IgM IgG IgA IgD IgE 2、可变区和恒定区（1) 可变区（variable region, V区) ） N端重链1/4和轻链1/2 组成，AA的种类、排列顺序与构型变化很大。 VL区存在3个超变区（hypervariable region, HVR13) VH有4个超变区 超变区共同组成Ig 的抗原识别部位，形成与抗原决定基 互补的表位。超变区也称互补决定区（complementarity- determining region, CD13)。 4个骨

13、架区（framework region, FR14). AA替换频率较低 的的部分。（2）恒定区：C端重链3/4和轻链1/2 组成，AA的种类、排列 顺序及构型相对稳定免疫球蛋白Ig的酶解片断1 木瓜蛋白酶 2个Fab 段结合抗原 1个Fc段 结合细胞2 胃蛋白酶 F(ab)2段:双价抗体活性 pFc段： 无生物学活性胃蛋白酶木瓜蛋白酶FcpFcF(ab)2Fab 抗体分子的酶切片段Ig与抗原的结合区 Ig的基因结构三个基因簇H重链轻链轻链小鼠轻链基因库的组成小鼠轻链基因库的组成小鼠重链基因库的组成 基因重排V-J基因重排每个V基因下游有个CACAGTG-12/23bp-ACAAAAACC序列

14、，而每个J基因的上游有个与之互补的序列；在重组酶的作用下，任一个V基因可以与任一个J基因重排（发生在B淋巴细胞成熟时）V-D-J基因重排轻链基因的重排、RNA处理和蛋白质表达的过程重链基因的重排、RNA处理和蛋白质表达的过程 抗体分子的多样性 抗体分子的人源化改造单克隆抗体技术的局限：鼠源抗体可能与人体产生排斥反应人体的某现特殊抗原无法免疫小鼠杂交瘤细胞稳定性差、产量低抗体基因可变区基因的克隆：PCR引物应具有通用性，能够与数百个VH片断中的任一个、6个JH片断中的任一个结合；引物可选择可变区上的保守区。改型抗体：目的是得到高亲和力的治疗抗体设计嵌和FR(骨架区)人抗体基因库的应用计算机模拟技术的应用 抗体的表达系统 小分子抗体小分子抗体是缺少Fc部分的抗体医学上的优缺点可以由E.coli表达FabFvVH 需要加入前导肽序列，作分泌表达dsFv(二硫键稳定的Fv抗体)通过替换Cys，然后在体外引入二