壳寡糖制备方法综述

1、壳寡糖制备方法研究进展邓培昌*胡杰珍侯庆华黄来珍（广东海洋大学海洋与气象学院,湛江524088）摘要：水产品加工行业副产的大量虾蟹壳不能得到充分高值利用，造成资源浪费、环境污染。壳寡糖作为虾蟹壳的高值衍生物，具有高的生理活性，广阔的应用空间。壳聚糖降解是由虾蟹壳制备壳寡糖的关键环节。开发环保的、经济的、易于工业化的壳聚糖降解技术是突破壳寡糖制备瓶颈的主要方向。壳聚糖降解的基础研究是开发壳寡糖新生产方法的根本。关键词：壳聚糖,壳寡糖,电化学,降解ResearchProgressonPreparationofChitooligosaccharidesDengPeichang*HuJiezhenHo

2、uqinghuaHuanglaizhen(CollegeofOceanandMeteorology,OceanUniversityofGuangdong,Zhanjiang524088)AbstractTheshrimpandcrabshell,whichisbyproductinAquaticProductsProcessingIndustry,istooplentifultotakefulladvantage.Abandoningtheshrimpandcrabshelliswastingofresourcesandenvironmentpollution.Chitooligosaccha

3、rides(COSs),whicharethehighvalue-addedderivativesofshrimpandcrabshell,areofgreatinterestsincetheyarethoughttohaveseveralinterestingbioactivitiesandapplications.ThedepolymerizationofhighmolecularweightchitosansiscriticalprocesstogetCOSs.Thedevelopmentofchitosansdegradationtechnology,whichisenvironmen

4、tally-friendly,economicalandsuitableforindustrialization,isabreakthroughofthebottleneckofCOSsproduction.KeywordsChitosan,Chitooligosaccharides,Electrochemistry,Degradation壳寡糖也叫壳聚寡糖，也称几丁寡糖，学名01,4-寡糖-葡萄糖胺，是壳聚糖降解而得的高端衍生物，是含有氨基的低聚糖。壳寡糖的化学结构与植物纤维非常相似，被称为可食性动物纤维素，它是多糖中唯一带正电荷的小分子物质，并具有稳定的三维结构，特殊的生理活性。壳寡糖在医

5、药、保健品、化妆品、农药、饲料添加剂等方面具有广阔的应用前景，被称为生命的“第六要素”。部分发达国家非常重视壳寡糖的制备、性能与应用研究。在二十世纪九十年代，日本政府开始推动壳聚糖应用，随着壳寡糖制备的技术进步，现在壳寡糖的应用已经得到普及。1995年，欧美已经批准了壳聚糖在药物方面的利用。我国也于1996年成立了专项研究甲壳素系列的课题组（中国科学院天然产物与糖研究组）。因此，如何有效的通过一系列物理和化学或生物的方法制备壳寡糖，日益受到各国科学家的关注。壳聚糖的降解方法可以分为化学法、物理法、酶法几大类:1.化学法化学降解法是指通过化学反应使壳聚糖降解。它简便易行，但降解产物相对分子质量较

6、难控制，相对分子质量分布较宽，污染较重。目前，通过化学法对壳聚糖进行降解主要分为酸法和氧化法。通信联系人：邓培昌（1975-）,男,讲师,博士,主要从事功能材料的制备与性能研究。E-mail: HYPERLINK mailto: 1.1酸降解法壳聚糖易被稀酸催化发生苷键断裂而降解。酸降解机理是糖分子中的苷原子氧接受质子而形成了质子化的苷键，从而削弱C-O键，进而发生断裂，同时形成碳阳离子的中间体，该中间体在水存在下生成游离的糖，其反应历程为：图1壳聚糖酸降解反应机理酸降解法用的催化剂可分为两类：无机酸，如HCl、H2SO4、H3PO4、HNO2和HF1等；其中HCl和H2SO4水解条件基本相同

7、，但硫酸有氧化性易使水解产物碳化；H3PO4、HNO2的酸性稍弱些，HF腐蚀性又太强，故使用HCl降解的较多。使用无机酸对壳聚糖进行降解反应时间越长、温度越高、酸浓度越大、所得降解产物聚合度越低，甚至可获得单糖。有机酸，如乙酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸和酒石酸等；在草酸溶液中，壳聚糖降解速度最快，在苹果酸中最慢2；与无机酸相比，使用有机酸催化壳聚糖降解所获产物聚合度较高。盐酸降解法：该法开发应用较早，Baker等早在1958年将制备的壳聚糖溶解于3.3mol/L的盐酸溶液中，在100C条件下反应32h，得到了聚合度为17的氨基葡萄糖。Rupley等对浓盐酸降解甲壳素制备低聚壳聚糖进行了系统

8、的研究。实验中发现，随着盐酸浓度增大、温度升高，降解速率也加快。刘晓等5在使用不同浓度盐酸对壳聚糖的降解试验中发现，在100C并有氩气保护条件下，盐酸在降解壳聚糖的同时，对所生产的单糖分子结构具有较强的破坏作用。总之，盐酸降解法操作简单，但降解条件较难控制，操作环境污染严重，降解产品主要为单糖和双糖，活性较高的寡糖含量较低。硫酸降解法：硫酸在降解过程伴有O和N基上的磺酸化副反应，且卩-1,4糖苷键断裂无规律。与乙酸酐混合降解时可获得23聚合度的壳寡糖6。磷酸降解法:用强度较弱的磷酸对壳聚糖进行降解制备壳寡糖。Makot。等对浓磷酸降解壳聚糖作了较为深入的研究。Jia等研究了在不同时间和不同温度

9、下用磷酸降解壳聚糖的工艺，发现时间越长，产率越低；温度越高，产率越低。酸降解法所用试剂价廉易得，易于实现工业化，但壳寡糖的产率较低，主要得到的是单糖、二糖，难以得到所需要的活性低聚糖。另外，酸降解法引入了强酸，后处理比较困难，会给环境造成一定的污染。1.2氧化降解法氧化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法。由于H2O2氧化降解壳聚糖具有反应速度快、产率高、对环境友好等优点，是一种比较理想的化学降解方法。其他的氧化降解方法还包括H2O2/NaClO法、NaBO3法、过醋酸法等方法。通信联系人：邓培昌(1975-),男,讲师,博士,主要从事功能材料的制备与性能研究。E-mail: HYP

10、ERLINK mailto: 过氧化氢降解法:H2O2降解过程是利用H2O2在水溶液中电离形成的各种游离基团ho2、HO及(O),其中高活性的HO和新生态的(O)具有极强的氧化性，它们攻击壳聚糖上带有活泼NH2+的卩-(1,4)苷键，致使其解聚。我国学者9-11研究了在酸性、中性、碱性条件下过氧化氢对壳聚糖的氧化降解反应。结果表明，采用过氧化氢溶液，在不同反应温度、反应时间下，产物大部分为水溶性低聚糖。其它氧化降解法：鉴于UV或NaClO与H2O2在降解过程中存在一定的协同效应，为了提高降解速率，在H2O2氧化降解的基础上出现了UV/H2O2、NaClO/H2O2等氧化降解法。黄 群增等12对

11、1.5%醋酸溶液介质、双氧水用量比(与糖质量比)2.5、室温下紫外线照射lh后，可制得平均分子量为2.8万的低聚壳聚糖。张文清问控制NaClO/H2O2在0.25、氧化剂总量为0.6mol、在pH值68、55C温度下，对60g壳聚糖降解5h可使产品的分子量低于3000。通过对降解产物的红外色谱分析及氨基含量分析表明，降解过程对产物中氨基含量影响较小。化学氧化降解法见效快，但需要消耗化学氧化剂，会直接或间接污染环境，降解产物质量不易控制，分离也有一定的困难。2.物理法物理降解法主要有超声波降解法、Y射线降解法、微波场降解法及机械法。超声波降解法：降解的主要机理是机械性断键与自由基的氧化还原反应1

12、4,150超声波降解法的影响因素主要是超声波作用时间迢17。随着超声波的作用时间延长，壳聚糖降解率逐渐增加且所得低聚壳聚糖相对分子质量分布明显变窄，得到较为均一的低聚壳聚糖，同时降解过程中氨基的含量不变，脱乙酰效果也不改变18,19。用傅里叶变换红外光谱和X-射线衍射分析壳聚糖超声降解产物时，发现壳聚糖的卩-(1,4)苷键发生断裂，降解前后晶态没有变化20。辐射降解法：Y射线辐照降解壳聚糖机理主要有两种观点21：一是直接作用，即糖苷键的成键电子被Y光子激发，引起键断裂；二是间接作用，即辐射产生的电子、自由基等产物通过化学反应加速糖苷键的断裂，生成低聚壳聚糖。采用辐射法降解壳聚糖时，辐射剂量与脱

13、乙酰度对降解速度有很大影响。辐射剂量和脱乙酰度越大，降解越快；但辐射量达到一定值后，壳聚糖的相对分子质量降低变缓凹。壳聚糖溶液经Co60y射线辐照后物理和机械性能发生变化23，壳聚糖溶液经辐照后颜色发生变化，辐射剂量越大，颜色改变越明显，壳聚糖的抗张机械性能也降低了，分析认为辐照后壳聚糖主链断裂，在链端基功能团C=O含量增多所致。光降解法：紫外线、可见光和红外线对壳聚糖的辐照也可使壳聚糖降解24，当辐照的波长小于360nm时降解反应较明显。有学者25发现在用紫外-可见光度计测量壳聚糖的降解程度时发现，在紫外光照射下，壳聚糖的降解程度有所提高。红外光谱分析表明，光降解过程中壳聚糖分子链上的乙酰氨

14、基葡萄糖单元发生脱乙酰化反应，导致氨基的数量增加，同时使卩-(1,4)糖苷键断裂。微波降解法:降解的机理为微波诱导粒子移动或者旋转，导致极性粒子产生偏振现象，使粒子间发生摩擦、产生热量、分子断裂产生相对分子质量大小不等的片段，同时转变为自由基，自由基不稳定从而形成低聚壳聚糖。微波降解壳聚糖，所得产品相对分子质量与反应时间及辐射能量有关，延长反应时间，增大辐射能，所得相对分子质量越小，分布越窄。应用此法对壳聚糖进行降解需要无机盐(如NaCl)或H2O2协助，无机盐的加入对降解产品质量无影响，所得产品平均分子质量在900100026,27。机械降解法：目前机械法降解壳聚糖的主要是高压均质和机械研磨

15、。周今朝等28研究了高压均质法降解壳聚糖，发现分子量和均质压力的增大，以及循环次数的增加，均有利于降解。溶液环境和操作温度，对降解基本没影响。蒋林斌等人29研究了搅拌球磨机械活化降解壳聚糖的工艺，考察了机械活化时间、温度及搅拌速度对壳聚糖溶解度和分子质量的影响。物理降解法设备单一，不会引入杂质，但是目前大多数的物理方法还只是处于实验室研究阶段，要实现工业化生产，还必须进行更深入的研究。3.酶降解法酶降解法就是利用特定的酶对壳聚糖进行降解的方法，其反应条件温和，不必加入其他反应试剂，不发生其他副反应，产品均一性好，产物聚合度适中，节能、高效、无污染。所以，近年来国内外对酶法制备壳寡糖的研究，包括

16、产酶的微生物、酶的特性及酶的分子生物学等方面的研究十分活跃。酶解法制备壳寡糖所用的酶，分为专一性酶和非专一性酶。专一性酶包括壳聚糖酶、葡聚糖酶、部分蛋白酶等30-32，非专一性酶有脂肪酶、溶菌酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等33,34。壳聚糖酶以内切作用方式催化降解壳聚糖，生成聚合度为6左右的壳寡糖。壳聚糖酶对糖残基的。6上连接何种基团的选择6性较差，许多C6-OH的取代物如羧甲基甲壳6素也能被降解，而对糖残基的C2上的N-乙酰基要求严格35。溶菌酶能够在酸性条件下迅速地降解壳聚糖，断裂连接D-氨基葡萄糖和D-乙酰基氨基葡萄糖的卩-(1,4)糖苷键，得到低分子量壳聚糖。Einosuki等36利用从Tr

17、ichodermariride提取出来的纤维素酶，在50C和pH值为5.6的条件下水解壳聚糖，得到主要为68糖的壳聚糖的低聚糖。黄永春等37将木瓜蛋白酶应用于壳聚糖降解中，他们研究了不同条件下降解速率的变化。结果表明，木瓜蛋白酶只选择性地降解GlcNAcGlcN糖苷键，反应最适pH值和温度分别为4.5和45C。它的优点主要在于木瓜蛋白酶价钱便宜、稳定性好，对壳聚糖的降解效果比较高。Kittur38等将果胶酶应用于壳聚糖的降解。研究显示A.niger果胶酶对壳聚糖及其衍生物有着较好的降解能力，反应的最佳作用条件是温度47C和pH为3.0,而且遵守经典的Michaelis-Menten动力学方程，

18、生成的壳聚糖的分子质量范围在5000到20000之间，且具有较高的结晶性。中国科学院大连化学物理研究所格莱克壳寡糖研究中心主要研究酶法降解壳聚糖制备壳寡糖，已掌握了大量的科学技术，申请了一批专利，为我国壳寡糖的研究与应用做出了卓著的贡献。生物法生产周期长，酶的提纯难度大，生产成本较高。4电化学方法在壳聚糖的降解与制备中，电化学方法是新方法。Cai等朗以Ti/TiO2-RuO2电极为阳极、不锈钢为阴极、在醋酸体系中，施加一定的电压，实现了壳聚糖的降解，在壳寡糖的制备原理方面做出了贡献，但是他们所制备的电极寿命较短。黄永春等40以石墨为电极，电解含氯化钠的壳聚糖溶液，考察了电流密度、温度、氯化钠浓

19、度、初始pH、初始壳聚糖浓度、极板间距在电化学反应过程中对壳聚糖降解的影响，对电化学间接氧化降解壳聚糖进行了研究，他们对电化学参数进行了较为详尽的研究，但是选用了很传统的石墨电极，难以避免电极失效问题。虾蟹壳壳寡糖应用广资源丰瓶颈图2壳寡糖产业发展“沙漏”模型电化学法具有成本低廉、容易控制、容易实现工业化的优点，应成为近期壳寡糖制备研究的重点。5结论当前壳寡糖产业发展的“沙漏”模型如上图，上端是水产品加工行业副产的大量虾蟹壳难以得到充分利用，下端是高附加值的壳寡糖具有广阔的应用空间，阻碍由虾蟹壳生产壳寡糖的瓶颈是缺乏适合工业化的壳聚糖降解方法，应加快壳寡糖制备方法的研究。在众多壳寡糖制备方法中

20、，酶法可以生产高品质、高活性的壳寡糖，近期仍是研究重点；电化学法虽是以新兴方法，但是从制备原理到实验装置都体现出了其明显的优点，其将是未来大规模制备壳寡糖的主要突击方向。参考文献：1DefayeJ.,GadelleA.,PedersenC.Aconvenientaccess邮-(14)-linked2-amino-2-deoxy-D-glucopyranosylfluorideand卩-(14)-linked2-amino-2-deoxy-D-glucopyranosyloligosaccharidesbyfluorolysisandfluorohydrolysisofchitosanJ.Ca

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