家畜繁殖新技术

1、家畜繁殖新技术繁殖新技术产生的源由：动物繁殖学为动物科学的专业基础课程动物繁殖学三大组成部分繁殖生理：生殖激素生殖生理配种受精妊娠分娩繁殖技术：人工授精同期发情胚胎移植体外受精等繁殖疾病：不育不孕生殖障碍影响繁殖技术发展的因素繁殖学是整个畜牧学科应用技术与理论研究发展最快的一门学科，繁殖技术又是现代生物工程技术(Biotechnology)的基础。前者体现在生殖内分泌的研究进一下丘脑对生殖的调控作用，后者突出表现在核移植技术的成功六次革命人类作出了三大创举：曼哈顿计划阿波罗登月计划人类基因组计划生物工程技术的概念：利用生物体系应用先进的生物学和工程技术加工或不加工底物原料以提供所需的各种产品或

2、达到某种目的的一门新型的生物科学技术。生物工程技术的作用：可大大提高动物的繁殖效率提高生长速度降低生产成本可改变畜产品的结构可培育人们需要的新的动物品种可用动物代替生物反应器繁殖新技术的内容生物工程技术在家畜繁殖上的应用基因重组利用技术转基因细胞融合利用技术嵌合体胚胎与核移植技术核移植组织培养利用技术体外受精细胞大量培养技术胚胎干细胞生物反应堆与酶技术酶工程胚胎分割的生理基础：胚胎发育早期的卵裂球具全能性即发育成一完整个体的能力胚胎分割的意义在于：可使可用胚胎数成倍生长、可获得遗传上几乎完全相同的后代、可作为生物学研究模型胚胎分割的方法归纳为四种：1、Willadsen的分割法程序：分割移入空

3、透明带双层琼脂包埋中间受体同种受体2、Williams的分割法程序：分割移入空透明带同种受体3、玲木分割法程序：透明带内分割注入大分子物质溶液同种移植4、简易分割法胚胎分割的应用前景与胚胎移植结合可提高受胎率可得到同卵双生后代在牛避免孪生母犊不育可作为理想的试验研究材料为胚胎性别鉴定提供了条件胚胎分割存在的一些问题体重并非完全相同毛色和斑纹往往有差异生出的动物出现异常与畸形嵌合体：两个或两个以上受精卵发育的复合个体嵌合体的制作：一、聚合法1、胚胎聚合法（程序）：1）采集胚胎2）除去透明带3）洗涤4）配对5）融合化学融合法（聚乙二醇法.仙台病毒法.外源凝集素法）-电融合法6）培养7）移植2、卵裂

4、球聚合法（程序）（同胚胎聚合法）将两枚或两枚以上胚胎在除去透明带后将离散的分裂球按需要取出共同放入一空透明带内PHA集合琼脂包埋移植二、囊胚注入法又称向囊胚内注入细胞法优点：1）对着床需透明带的动物十分有利2）既可制造ICM嵌合体又可使TR成为嵌合体三、囊胚重组法嵌合体的标记标记物必需满足的条件1）固定在细胞内的物质不能跑到细胞外2）稳定存在于最初标记的细胞及因分裂而增殖的细胞3）发育期间普遍存在于机体外组织4）应当容易识别5）在胚胎中应处于中性标记方法1）人工标记-活体染色素或油等珠状物放射性物质等2）遗传标记-反应生物个体或群体特征的某些性状物质体外受精：将动物的精子与卵子置于体外在人工条

5、件下完成受精的过程称为体外受精体外受精的优点：基础研究方面1能直接观察到受精的动态过程2可以得到难以得到的一些动物的受精卵应用研究方面3可以作为治疗不孕症的一种方法4可为其它新技术的应用提供更多的胚胎来源体外受精的程序配子获得输卵管卵+体内获能的精子输卵管卵+体外获能的精子卵泡卵+体内获能的精子卵泡卵体+外获以能的精子卵子的采取非激素处理法激素处理法精子的采取屠宰法射出的精子2配子培养培养基单纯培养基复合培养基配子处理与培养系统精子处理1）Percoll密度梯度离心法2）精子上游分离法精子孵育诱发获能+体液（卵泡液、血清等）+限定培养液或合成培养液方法1）高PH孵育法2）钙离子载体法3）肝素钙

6、孵育法培养系统：开放式培养系统、封闭式培养系统和滴培养滴培养：培人皿-培养液-卵子-冲洗-石腊油-CO2培养箱培养（动物有特定温度表）卵子成熟的标志卵丘细胞的成熟判别：1）卵丘细胞的分散程度2）卵丘细胞内空泡变大3）卵丘细胞异染色质增多、核孔明显、核空泡化卵母细胞核的成熟判别：4）核迁移至动物极质膜下成为生发泡（GerminalVesicle,GV）卵母细胞质的成熟判别：5）胞内皮质颗粒由匀散状态向质膜下迁移6）高尔基复合体由核周围移向皮质迁移-消失7）线粒体由核周围皮质区核周围8）早期粗面内质网（RER）丰富成熟时RER减少授精（分配卵子到精子悬浮液中）过程看到的现象：1、在透明带表面可以看

7、到很多精子2、多精子受精频率增加3、精子超活化现象受精的标准1）少数动物卵母细胞内可见到精子2）卵母细胞质中有膨胀的精子头部3）卵周隙内存在第二极体或明确的第一极体4）卵子激活排出第二极体5）雌雄原核形成并融合6）卵周隙变大有时见到精子影响受精的因素：温度精子数培养的条件牛体外受精操作程序：1配制配子洗涤液、培养液、受精液2采集处理配子3授精体外受精液中有关成分的作用犊牛血清和血白蛋白乳酸丙酮酸咖啡因和肝素3FSH和PMSG精子注射：把精子直接注射到透明带下卵周隙中或注意到卵细胞质中有人将前者称为精子转移或精子植入，后者称为精子注射精子注射处理与要求：注入细胞质的精子可以是不活动的精子或精核注

8、入卵周隙的精子应为活动的已获能的和已发生顶体反应的精子才能获得较高的受精率为避免精子在注射针内移动必需限制精子活动：一是将精子加入含有甲基纤维素的粘稠培养液中二是将精子冷却到10oC三是为便于精子注射可设法加大卵周隙：生精细胞显微受精生精细胞显微受精是利用变态前的球形精子细胞（次级精母细胞或初级精母细胞）与不同发育时期的卵母细胞进行受精它包括透明带下授精和卵母细胞质内受精3.1意义与作用：揭示雌雄配子间的相互作用和受精本质保护和挽救濒危珍稀动物品种利用初情期以前幼年动物繁殖后代治疗老龄与先天性异常引起的雄性动物不育症若用精细胞进行转基因所得的后代一定是全部携带目的基因的个体将分离到体外的精细胞

9、移植到睾丸中没有精细胞的小鼠曲精细管内可获得移植精细胞发育的后代3.2方法电融合法卵胞质内注射法3.3技术研究与应用细胞周期与卵激活差异正常受精卵子停滞于第二次减数分裂中精子已完成减数分裂显微受精显微受精成功的动物与存在问题成功的动物：小鼠刘灵等仑鼠兔存在的问题：2/3的雄原核较小但不影响胚胎进一步发育ICSI与IFV比较25%受精卵不能同步形成雌雄原核7%受精卵可能形成3个原核体外受精胚胎在体外的发育往往不能与子宫完全同期化，在囊胚移植时需要做辅助脱出透明带处理，而且体外受精的结果不同。核移植1、概念：借助显微操作和细胞融合技术把遗传型不同的胚胎细胞核和卵细胞质相结合重组成新的合子的过程得到

10、的胚胎称为重组胚（reconstitutedembryos）或核移植胚2目的：1）查明胚胎细胞核和体细胞核是否保持合子细胞核的全部遗传信息2）体细胞核是否能代替合子核所起的作用3）转移供体核基因生产多个同基因动物4）作为动物和人类疾病模型5）作为生产药物的天然工厂现代生物学中克隆技术又称为“生物放大技术”它经历三个发展阶段：1）微生物克隆2）生物技术克隆3）动物克隆克隆技术发展的过程哺乳动物核移植的起始人Mcgranth和Solter第一个报道成功的是Illmensee和Hope核移植必须具备的条件显微操作设备2制作吸管装置3体外培养系统核移植的方法核供/受体细胞来源与当前需要解决的问题核供体

11、：胚胎细胞：目前主要是用桑椹期前的卵裂球成体细胞：胎儿的成纤维细胞乳腺上皮细胞输卵管细胞卵丘细胞孤雌生殖细胞成体细胞从增殖的角度可分为三类：1）连续分裂细胞2）休眠细胞3）分化细胞核受体：处于中期II的卵母细胞调节细胞周期的方法其一采用人工捕获的方法，即通过限制细胞培养基中某些成份，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段；其二通过选择细胞类型来获得当前需要解决的问题：远缘细胞核移植受体细胞选择关于核供体和核受体细胞质的协调性重构胚的卵裂速度与供核体细胞的发育速度一致与生殖系统关系越密切的细胞重构胚发育潜力越大核质重构后代性状主要与供体相似或为核质混合状态性别控制方法X和Y精子的分离X和Y精子

12、的分离方法A沉降法B密度梯度离心法：C电泳法D流式细胞分选法性别鉴定1非损害性方法1）测定与X染色体相关联的酶的活性2）免疫法（HY抗原法或单克隆抗体法）方法：免疫动物选择（高度近交系）制备抗血清HY抗原检测A细胞毒性分析法B免疫荧光分析法C囊胚形成抑制法；损害性方法1）细胞遗传学分析（又称核型鉴定）特点准确率100%获得高质量的中期染色体分裂相难取样滋养层细胞卵裂球分割半胚2）分子生物学分析法（DNA探针（原位杂交技术FISH）方法以待检测的核酸序列为模板用TAQ酶催化引物限制DNA合成经变性退火延伸三个步骤可使扩增片断以2N的指数积累即在2小时内使待检测的核酸扩展数百万倍特点特异好灵敏度高

13、简便快速难点分离Y染色体序列分离SRY序列确定序列位置及拷贝数转基因是将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎使之稳定整合于动物的染色体组并能遗传给后代的技术。能检测出导入新DNA的动物就称为转基因动物。通过使用实验手段将外源基因导入动物的生殖细胞并由此发育成个体且整合外源基因又能向后代遗传的动物称为转基因动物。携带外源基因并能表达遗传的动物称为转基因动物而外源基因可能只整合入动物部分组织、细胞的基因组，称为嵌合体动物。转基因的意义经典育种方法的限制性遗传信息只能在同种或亲缘关系很近的种间才有可能交换重组选择的条件是变异或突变自然变异的比例不足1%可在没有亲缘关系的种间进行遗传信息交换和重组可在很

14、短时间产生服从于人们需要的突变具体表现在：可作为生命现象解密的工具1）转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究；2）可以提高家畜的经济性状3）可从遗传上改变畜产品的组成结构4）以家畜为宿主生产有用的生理活性物质转基因技术的优点：可以培育出生产性状优良的超级动物群可以制备出高增殖的蛋白和激素类药物可以按人的需求提供动物产品二家畜转基因的方法原生质体融合法重组病毒感染法微细胞介导法高速冷冻法细胞融合法显微注射法精子载体法胚胎细胞介导法逆转录病毒法等乳腺暂态表达家畜转基因的方法显微注射法（microinjection）在显微镜下借助玻璃微吸管将外源基因注射进细胞的一种方法。这种方法是建立得

15、最早也是最有效的方法其最大的优点是基因转移率高不需原核载体DNA片段导入外源基因长度可达100kb精子载体法既往精子作载体所采用的方法为体外孵育法，如今有采用体内转染法：这其中可将外源基因直接导入精细管，可直接导入附睾管。胚胎干细胞介导法这种方法的优点：囊胚腔易于注射整合率高（50%）可在体外对靶细胞进行基因的定位插入整合可对目的基因型干细胞进行克隆难点：EK/ES细胞株的建立原始生殖细胞介导法原始生殖细胞（PrmordialGermCell,PGCs）介导法与ES法技术原理和方法相似。5逆转录病毒感染法（Retrovirusts）方式：1）48细胞胚胎先去除透明带与反转录病毒共培养病毒感染胚

16、细胞病毒的RNA被逆转录成病毒DNA这样DNA就可能被整合到胚胎细胞中去体外培养1624小时移入受体。2）将浓缩的病毒或产生病毒的细胞注射到48细胞的透明带下同上。优点：无需显微操作感染率高宿主范围广可以同时处理大量胚胎外源基因为单拷贝整合可直接进行囊胚腔注射。缺点：1）得到的大部分是嵌合体外源基因遗传给后的很少2）每一基因都要构建一个重组逆转录病毒载体3）这种载体容量小通常为7kb大于9.4kb就不稳定6、非病毒载体介导法脂质体介导法：脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞

17、内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。受体介导法体细胞核移植法（转基因克隆）将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。乳腺暂态表达乳腺基因导入的方法有两种：乳头管导入法乳腺直接导入法不同转基因方法技术效果比较1显微注射法优点：外源DNA大小基本不受限制（l-50kb）；导入过程直观；整合率高;缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随

18、机性转基因沉默2胚胎干细胞介导法优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便缺点：ES细胞系建立及培养困难；维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易；所得个体为嵌合体；逆转录病毒感染法优点：受精卵携带外源基因的阳性率高；外源基因多单拷贝整合；操作简单，避免注射法对卵子的损害；宿主范围广；可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高；缺点：容纳大小有限；潜在致癌性,载体复杂；整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性；与微注射相比，对插入序列的容量有限，总长大于9.4Kb，就不稳定或很难成活,通常为7

19、Kb。通过这种方法引入的DNA的表达取决于内部的启动子。体细胞核移植法优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术YAC法利用酵母人工染色体（YAC）作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（YAC）载体是近年来发展起来的新型载体，能克隆百万对碱基的大片段DNA。优点：保证大片段DNA的完整性保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率高保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性,因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。因此YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。转基因的整合和表达外源基因的整合的机制目前尚不清楚,整合效率与DNA

20、的浓度,结构形式,以及卵母细胞来源都有一定关系外源基因在转基因动物体内的表达主要有三种方式：A、细胞内特异表达，大多为这种方式，表达量与内源基因相似；B、外源基因在所有器官显著表达，改变了动物表型和原来形状；C、外源基因在动物发育的适当时期与内源基因一起激活。大部分转基因在宿主基因组中的表达比较低的,之前对这种现象的解释是转基因受位置效应的影响。现在认为之所以不表达是由于多拷贝重复序列导致了该区域异染色质化,从而使转基因沉默。培养转基因家畜的技术问题第一是技术本身的问题：理论基础积累不足和技术不完全，结果随机整合，且整合率低；家畜的外源基因的整合率低于实验动物。一般是高度近交系品种整合具有稳定

21、性。表达率不高,产生的转基因动物效率低。不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制。第二是家畜本身的问题：排卵数的差异，卵细胞透明度差，采集原核期胚胎的准确时间难以把握，妊娠期长产仔数少费时耗资大。六基因敲除和基因嵌入技术基因敲除简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除基因嵌入（geneknockin）又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。干细胞：是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞胚胎干细胞简称ES/EK细胞，是一种从早期胚胎ICM或原始生殖细胞（PrimodialGarmCellsPGCs）图，经体外分化抑制培养分离和克隆得到的具全

22、能性的细胞（图6-3）。2干细胞的类型（表6-1）成体干细胞胚胎干细胞（全能性多能性多向分化/跨系分化单向）一研究进展1958年Stevens最早发现畸胎瘤细胞（EmbryoniccarcinomacellEC）,他通过把小鼠早期胚胎移植到129只小鼠精巢或肾脏的被膜下得到EC细胞。这些细胞可在体外进行培养，被用作研究动物胚胎发育与遗传，以及细胞诱导分化的实验模型与正常胚胎的未分化细胞极为相似胚奖体。注入囊胚可形成嵌合体（但常会形成肿瘤或导致胚胎死亡）有胚胎细胞发育的多能性在体外能不断增殖并保持不分化的状态多数EC细胞不具正常的二倍体核型，染色体数也不完整ES细胞的特征：全能性和相当于4.5日

23、龄的胚胎细胞；具胚胎细胞特征核型，为正常二倍体；具外分化能力，皮下接种可产生畸胎瘤。目前研究的侧重点在于：1）ES细胞系的建立条件2）影响因素的探讨3）细胞核型的稳定性及变异4）ES细胞系的利用途径用PGCS建立干细胞系虽然由于其迁移特性导致贴壁率较低但来源比较丰富一存在问题：不同细胞系和同一细胞系不同亚系之间细胞的多能性和注射到胚胎腔后参与生殖系典型嵌合的能力不同分离到的ES细胞在以后的培养中由于实验室的条件不同或培养条件中某些不良因子作用和积累以及倍增水平的增加ES细胞的染色体也会出现不稳定。胞质对后代的影响还有待研究克隆胚的培养冷冻及重复克隆仍有待改进和提高体细胞克隆其技术还待完善和提高

24、成功率大型动物克隆还有亟待解决的问题二建立ES细胞系的方法与步骤1建立ES细胞系的条件使ES细胞成千上万倍的克隆而不分化STO（小鼠成纤维细胞无限系）成纤维细胞PMEF（原始成纤维细胞）前者国外已商品化饲养层细胞具上述作用的原因：这两面类细胞可释放出成纤维细胞生长和分化抑制因子，如白血病抑制因子2饲养层细胞的制备用STO或胎儿成纤维细胞试验表明后者优于前者方法：1）取适龄的胎儿一去头内脏及血管一剪粹一蛋白酶消化一取细胞液一置DMEM中培养细胞贴壁生长后胰蛋白酶消化分离细胞培养2）生长抑制处理一是辐照二是加丝裂霉素ES细胞的分离：ES细胞取自附植前的胚胎措施：一要选择适当胚龄的胚胎二要采用正确的

25、分化抑制物方式一是免疫外科手术法消化透明带、滋养层细胞以暴露内细胞团二是直接机械剥离法将胚胎培养至孵出囊胚阶段然后用机械方法直接捡出内细胞团细胞前一种方法，分离率高，所得细胞的数量多，但复杂繁琐；后一种方法简单易行，但滋养层细胞不易去除干净。如何确定内细胞团细胞的全能性：目前多采用AKP和SSEA1进行检测三是热休克法四是延缓着床法ES细胞的培养ES细胞在经处理的饲养层细胞上培养液是DMEM其中还要添加血清、巯基乙醇、四种核苷酸及少量必须氨基酸抗菌素等值得注意的是：1）培养时及时定期更换培养液2）细胞系生成后要及时转移消化、克隆传代或冷冻保存5ES细胞系的验证明体外细胞形态特征体积大小一致细胞

26、核大胞质胞浆少细胞排列紧密边缘整齐完整核型上可见核和核仁与完整的染色体数和整倍体核型在没有饲养层的情况下体外悬浮培养能分化成多种组织体内将ES细胞注射至皮下产生畸胎瘤或与正常胚胎嵌合构成嵌合体三应用前景探讨早期胚胎发育的条件研究早期胚胎组织分化的发生与诱导用ES细胞与正常胚胎细胞嵌合在体外重建胚胎三种方法核移植法细胞聚合法囊胚注射法重组前可根据目的和试验设计需要对ES细胞进行处理得到特殊用途的动物ES细胞体外定位整合外源DNA对于研究有关早期胚胎发育与表达中基因的活动及其功能有十分重要的意义：利用ES细胞体外定位整合外源DNA通过对特定基因的灭活或修复得到转化的ES细胞可以在体外培养中观察其细

27、胞生理及生化性质变化引入动物种系后可间接了解基因的功能与作用机理可通过动物模型对人类的某些遗传疾病进行模拟定位，整合的原理是DNA的同源重组其程序：构建同源序列（靶序列）一一引入ES细胞产生同源重组（即外源DNA取代与其同源的染色体DNA片断而进入受体基因组）引入的方法：病毒感染法显微注射法电穿孔导入法基因打靶：1）选定要改造的基因2）克隆该基因的全部或部分DNA序列（靶序列）3）克隆靶序列的载体（靶载体）插入或目的基因靶序列从靶载体上切下来筛选整合外源DNA的ES细胞构建嵌合体关于ES细胞的研究在人类疾病的治疗具有重要的潜在价值干细胞又一个重要的潜在用途是生产细胞和组织，它们可用于所谓的“细

28、胞疗法”。许多疾病及功能失调往往是由于细胞功能障碍或组织破坏所致。虽然这项研究有着极为诱人的前景，但要使其成为现实，尚有许多工作和技术挑战等着我们去解决。首先我们必须做些基础研究，以理解导致人体中细胞特化的细胞事件，从而能够指导这些多能干细胞发育成移植所需的特殊组织类型。其次，在利用这些细胞进行移植之前，还必须克服免疫排斥问题。由于来自胚胎或胎儿组织的人体多能干细胞与移植受者在遗传上有差异，因此将来的研究将集中于改变人体多能干细胞，将组织不相容性降到最低，或是创建具有通用组织类型的组织库。ES细胞的分离培养原则上应满足两个条件：1促进ICM细胞增殖1）培养基DMEM适用于生长速度快贴壁性差的细

29、胞Evans和Kaufman2）添加剂的运用非必需氨基酸柠檬酸核苷酸硒酸钠丙酮酸钠等（作为蛋白质合成原料或提供能量物质）3）血清供给营养促进DNA合成（血清质量影响组织培养）4）生长因子对胚胎保持最佳生长速度有一定作用胰岛素样生长因子胰岛素表皮生长因子转铁蛋白成纤维细胞生长因子抑制ES细胞分化的因素：1）胚龄的选择用于分离ES细胞的胚胎，胎龄越小，分化程度越低，越具有全能性目前，各种动物一般采用囊胚期的胚胎来分离ES细胞。2）饲养层选择胚胎成纤维细胞用来制作饲养层后，能够抑制ES细胞的分化，其原理一般认为是饲养层能够分泌白血病抑制因子和aFGF、bFGF。目前采用的饲养层细胞有3种：STO（已建