博实验流程配套新景生物试剂盒自己有改动

1、分子构建操作步骤记住所有试剂在用之前先离心，防止试剂沾到管的盖子上。用之前先分装试剂，因为蛋白会变性。cDNX/pBlue. BamHI 10K BufferH2O段纯化1ul (ug/ul) 1ul2ul16ul载体处理PGEXBamHI 10K Buffer H2O9ul (ug) 1ul2ul8ul20ul 反应体系(轻弹混匀)20ul 反应体系(轻弹混匀)( in 1.5ml Eppendorf 管) 37C1hourin 1.5ml eppendorf管37C1.5hour去磷酸化上述酶切反应物P20ul1ul(1u)37C30min75C10min（ 75C 是为了使cilp 酶失

2、活）(洗电泳槽，1TAE 电泳缓冲液)大梳子跑胶 30min80V（最后做时好像是 111v？）各小组在同一块凝胶走胶，记下自己组顺序号切胶回收（见 Simgen 公司凝胶DNA 回收试剂盒产品说明。）准备工作：调整到 50C 水浴；在 Buffer WG 中按上指定的体积加入无水乙醇。两个 1.5 ml Eppendorf（自备）管的重量：为A 重量（g）分别将两小块胶（含cDNA 或载体）切下，放入各自的 1.5 ml Eppendorf 管，再次称重：为 B 重量（g）分别加入 3(B-A)ml 的 Buffer G（真正做实验的时候没有去称重量，大概算了下加 500 微升的 buffe

3、r WG,而不是 buffer G），50C 7min （使胶溶解完全）短速离心，使管壁和管盖上的溶液沉降到管底。将核酸纯化柱放入 2ml 离心管（试剂盒提供）中。将 1.5 ml Eppendorf 管中的溶胶液全部加入各自对应的核酸纯化柱中，5000rpm 离心 1 分钟弃去滤液，将核酸纯化柱放回到 2ml 离心管中，加入 0.5ml Buffer WS，5000rpm 离心 1 分钟（注意加 buffer 缓冲液的时候要沿着管壁慢慢加，不要直接把液体打到柱子上，这样容易把吸附在上面的 dna 打下去）弃去滤液，将核酸纯化柱放回到 2ml 离心管中，加入 0.7mlBuffer WG，50

4、00rpm 离心 1 分钟重复一次将核酸纯化柱放回到 2ml 离心管中，13000rpm2min，弃此 2ml 离心管将核酸纯化柱放入无菌 1.5ml 离心管（试剂盒提供）中， 在核酸纯化柱膜正中加 25ul BufferTE(具体加的时候 bufferTE 不要碰到管壁，要对着柱子的正中间把枪伸到离它距离很近只有几个微米的地方加，对着正中间加，不能碰到管壁，随着液体液面慢慢升高，枪也慢慢往上继续打出液体)静置 1min12000rpm1min，收集 DNA, 约 25ul（离心完一次后为了提高提取 dna 的效率可以把液体吸起来再重复此步骤一次，注意第一次离心前一定要静置至少 1 分钟，可静

5、置 1 到 3 分钟，效果更好，第二次重复离心时可以只静置 30 秒？）连接：上述回收产物 XDNA/pGEX 10ligase BufferT4 DNA Ligase17ul (X 14ulpGEX3ul) 2ul1ul充分混匀20ul 体系16 过夜，供转化用感受态细胞的：准备工作：制冰，42C 水浴，37C 摇床，37C 预热 LB用无菌吸管转移 25ul 过夜培养菌液至 5mlLB 小管中摇床，37 OC280 转/分 至OD=0.6 (约 2-3 h)菌液转移到 7ml 离心管中，冰上冷却 10（冷却的时候要盖上盖子，防止杂菌掉进去）4 OC ,4000rpm 离心 10，弃上清0.

6、1M冰冷 CaCl22ml 轻轻重悬离心同上（加 CaCl2之前要轻轻倒扣下）（最后一次加 CaCl2 后用枪吹打 4050 下，不要吹出气泡，打的时候只打出一半就不会产生气泡，吸一下打出一半不要全部打出防止产生气泡）0.1 M CaCl20.2 ml 轻轻重悬，转移到 1.5 ml eppendorf 管中（做好后把感受态细胞放到冰上供下一步用于连接产物转化）用于连接产物转化转化：准备工作：制冰，42C 水浴，37C 摇床，37C 预热 LB的感受态细胞加 20ul 连接产物 （剩余物放冰箱，下次转化使用）（连接产物：菌液的比例不要超过 1:10，把连接产物加到自备的感受态细胞中后，用手弹一

7、下）冰上 30 42 OC 水浴 90 秒（热休克，时间要求精确）（热休克是让细菌的膜通透性瞬间变大，让产物进去）冰上 2加 800ul LB(-) (预先 37 OC 预热)摇床，37 OC225 转/分 45 分钟（一般一个小时？，让质粒、细菌大量扩增繁殖，让质粒把抗性蛋白表达出来）400ul 菌液涂平板，37 OC 温箱中培养过夜（改了一下，2000 转 3 分钟离心后把细菌重悬再涂板，去掉 800-850 微升上清液，留 150微升，用来涂板，可以滴 6 滴左右，中间滴一滴，也可以全部滴到中间，用涂菌棒以放射状涂菌，涂均匀，保证菌液均匀覆盖平板，涂菌棒正常放在乙醇的烧杯里，然后放到灯上

8、烧，三泡三烧，烧下泡下乙醇，重复三次，主要烧涂的地方，最后烧完后凉一下再去涂菌，细菌烫死了，涂菌棒试温的时候不要接触琼脂板盖子的外面，以免弄上杂菌，可以接触琼脂板盖子的里面，琼脂板不化的时候或没有水蒸气的时候去涂菌，涂完后等琼脂板干了吸附完菌后平板要倒扣，因为温箱中温度高水蒸气变成水会淹死细菌）挑菌落（用弯镊夹取白色的枪头沾一下即可，挑一个清晰的菌落，选一个周围无杂菌，不是太大，也不太小的菌落，沾一下，不要沾两下也不要涂抹，然后连带枪头一起放到管里培养菌）小量 DNA 柱纯化转化菌（操作见 Simgen 质粒 DNA 小量试剂盒）准备工作：如果 Buffer出现沉淀，37 水浴溶解沉淀后再使用

9、（特别是冬天）；在 BufferW2 中按上指定的体积加入无水乙醇。12500rpm1min1.5 ml eppendorf (自备)2 次 回收沉淀每管（3ml 菌液）以 0.25ml 含 RNase A 的 Buffer I，使沉淀悬浮完全（votex）每管加入 0.25ml Buffer，温和地上下翻转使菌液裂解，至形成透亮溶液（此步骤5min，不得 votex）每管加入 0.35ml Buffer ，上下翻转，直至蓝色沉淀，产生松散的沉淀。13,000rpm10min将核酸纯化柱放入 2ml 离心管中。将上清加入核酸纯化柱，5,000rpm 离心 1 分钟弃去滤液，将核酸纯化柱放回到

10、2ml 离心管中，加入 0.5ml Buffer W1，5000rpm 离心 1 分钟弃去滤液，将核酸纯化柱放回到 2ml 离心管中，加入 0.7ml Buffer W2，5000rpm 离心 1 分钟将核酸纯化柱放回到 2ml 离心管中，13000rpm2min，弃此 2ml 离心管将核酸纯化柱放入 1.5 ml eppendorf (自备)中，在核酸纯化柱膜正中加 60ul Buffer E静置 1min12000rpm1min，收集DNA, 约 60ul酶切鉴定结果X/pGEX.EcoRI10 H Buffer H2O6ul 1ul 1ul2ul10ul 反应体系(轻弹混匀)37C1ho

11、ur1.5%琼脂糖电泳观察结果1 是否X2方向是否正确鉴定：正确方向产生 444 和 4979错误方向产生 47 和 5376PCR 实验目的：PCR 反应体系：25ul (加样顺序请参照下面)上游prim下游prim1(10uM)2(10uM)3ul 3ul 2ul 2.5ul 4ul 0.5ul补至 25ul模板：pEGFP-N1 vector10rtaq dNTPrTaq ddH2Obuffer25ulPCR 反应程序1234959556725min 1min 1min 1min24cycle 3072end10min56诱导表达及检测挑一克隆到 5ml LB 试管中摇床，37 OC用无

12、菌吸管转移 200ul 菌液摇床，37 OC (约 2-3 h)280 转/分 (过夜)280 转/分 至OD=0.6加入 0.5mM 的 IPTG 诱导表达 2 小时（即加 3ul/管）菌液转移到离心管中，12，000rpm 离心 2 分钟弃上清，沉淀加入 1.5上样缓冲液，混合均匀，沸水中煮 5 分钟，12，000rpm 离心 10min聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮兰染色用 40%及 20%脱色液脱色SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶模具的准备（根据厂家说明书，本的模具购自 Bio-Rad 公司）分别灌制分离胶和浓缩胶，分离胶浓度视目的蛋白的大小确定（7.5 - 15 %）蛋白样本加入 4加样缓冲

13、液，100煮 35 min 使蛋白完全变性，然后加样100200 V 电泳使分离卸胶，考马斯亮兰染色或 Western BlotWestern Blot取硝酸素膜或 PVDF 膜，盖在凝胶上，电转移 13 小时（电压 100V）（转移时间由抗原的特性以及转移缓冲液中SDS 的含量而定，一般为 1 小时）胶为负极，膜为正极取出硝酸素膜或 PVDF 膜，在TBST 缓冲液中短暂漂洗放入封闭液中，温和振荡 30 分钟把膜放入第一抗体中，温和振荡 30 分钟后放入 4冰箱过夜或室温下反应 2 小时回收第一抗体，在 TBST 中洗膜 30 分钟，中间更换TBST 23 次把膜置于第二抗体中，温和振荡 1

14、2 小时在 TBST 中洗膜 23 小时，中间更换 4 次以上依据膜的大小，取一定量的 ECL 溶液，将膜在溶液中准确温浴 1 分钟后，置暗盒中，2 秒60 分钟显影，定影沥干膜，用保鲜膜溶液的配制：4suffer分装后置20保存。Separating Gel PreparationStacking Gel Preparation (0.4% gel, 0.125 Mtris,6.8)ddH2O3.05 ml4.8 ml30 %丙烯酰胺0.67 ml1.064 ml0.5 M Tris-HCl6.81.25 ml2 ml10 % SDS50 l80 l10 % APS50 l80 lTEMED

15、5 l16 l7.5 %10 %12%12.5 %15 %ddH2O3.83 ml3.2 ml3.35 ml2.4 ml1.83 ml30 %丙烯酰胺2 ml2.64 ml4 ml3.36 ml4 ml1.5 M Tris-HCl 8.82 ml2 ml2.5 ml2 ml2 ml10 % SDS80 l80 l100 l80 l80 l10 % APS80 l8050 l80 l80 lTEMED8 l8 l5 l8 l8 l总体积8 ml8 ml108 ml8 ml终浓度Stock 液10 ml 工作液0.25 M Tris-HCl,6.82.5 M1 ml8 % SDS20 4 ml0.2 M DTT1 M2 ml30 % glycerol100 3 ml少量的溴酚兰考马斯亮兰：0.1 % 考马斯亮兰40