微生物实验课件：实验一 细菌的形态学检查

1、实验一、细菌的形态学检查一.明确临床微生物教学实验室守则二.不染色标本检查三.细菌涂片的制备和革兰染色一.临床微生物教学实验室守则1.为了做好个人防护，进入实验室必须先穿实验服和不漏脚趾的鞋。有条件应佩戴口罩、帽子和手套。不要佩戴戒指、手镯，长头发要挽起。2.实验室内禁止饮食、吸烟、随意以手抚摸头面部等行为。必要的书籍、文具和眼镜等带入后，不要放在操作台上应放在非污染区。3.每项微生物学实验，都要坚持无菌操作，最好在生物安全柜内进行。这样，既防止临床标本及纯培养物被污染，又防止病原微生物感染人体或污染环境。4.用过的吸管、滴管、试管、玻片等带菌器材，应放在指定的地方。5.禁止酒精灯互相点燃，以

2、防止发生意外。6.若发生割破手指，菌液进入口、眼或带菌材料破损、污染环境和物品等事故时，应立即报考老师，及时进行处理。7.实验完毕，应清理好自己实验台桌面。离开实验室前，应脱下实验服，放入专用容器内，在消毒液中将手浸泡510分钟（用洗手液7步洗手法或用肥皂洗三遍手），并用自来水冲洗干净。8.每次实验结束后留下值日生，把实验室环境打扫干净。并且关好水、电、门、窗后方可离开。二.不染色标本检查【目的要求】 掌握细菌的运动情况，以便观察细菌的动力。【器材和试剂】1.菌种 号铜绿假单胞菌和号金黄色葡萄球菌的4h新鲜肉汤培养物，各2ml。2.培养基 肉汤培养基。3.其他 洁净载玻片、盖玻片、接种环、酒精

3、灯 、显微镜等。【原理】 细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察，由于不染色的细菌遮光性强，所以，要观察视野的光线应相对暗一些，以便能看到细菌。鞭毛是细菌的运动器官，在新鲜的肉汤培养物中，有鞭毛的细菌，可见其从一处快速移到另一处（发生位置的移动），称之为动力阳性；而无鞭毛的细菌，由于受到肉汤中水分子的撞击在原地小范围内做往复的颤动，称之布朗运动，其动力则为阴性。从而可以简单间接反映细菌是否有鞭毛。也在细菌鉴定的过程中起到重要作用。【步骤和方法】压滴法1.接种环灭菌：先把接种环以15角在酒精灯外焰烧灼直到金属丝烧红，然后将接种环金属丝柄也回旋通过火焰烧灼灭菌

4、。放凉待用。2.用接种环分别取号菌和号菌的菌悬液23环，置于洁净载玻片两端。（也可以分别取标本，分别观察）（加盖玻片好些）3.先用低倍镜找到观察部位，再换高倍镜观察细菌的运动(适当关小光圈使背景应稍暗些)。【结果记录】号菌动力：号菌动力：【注意事项】1.为观察明显的运动状态，使用标本尽量新鲜。2.在操作过程中注意避免产生气泡。3.不染色标本的观察注意显微镜的光线调节，稍暗的视野有利于观察。4.将用过的玻片放进玻片缸里，在开始下一个实验。三、细菌涂片制备和革兰染色【目的要求】1.掌握细菌涂片制作的方法。2.掌握细菌的革兰染色原理和方法。【器材和试剂】1.菌种 号铜绿假单胞菌和号金黄色葡萄球菌菌2

5、培养基 血琼脂平板（Blood Ager)3试剂 革兰染色液4其他 洁净的载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜等。【步骤和方法】1.细菌涂片制备（1）涂片：用已灭菌的接种环各取生理盐水1环分别置于一张洁净载玻片两端，再将接种环灭菌，冷却后在固体培养基BA上分别沾取号菌和号菌单个菌落少许，在玻片两端盐水中分别磨匀，菌膜大小一般以1cm2左右为宜，随后将接种环在烧灼灭菌。(2)干燥：最好在室温下自然干燥；或将标本面向上，置于酒精灯火焰16cm高处缓慢烘干，切不可在火焰上烧干。(3)固定：将上述已干的涂片面向上缓慢通过酒精灯火焰1次，自然冷却，反复3次，等待染色。固定的目的杀死细菌；使菌体与玻片

6、粘附牢固，以免染色时脱落；使细菌的蛋白凝固，改变细菌对染料的通透性，使染料易于着色。2.革兰染色法(1)原理a.等电点学说：G+菌等电点低（pH23）而G-菌等电点高（pH45），在同一pH条件下（培养基pH一般是呈中性或弱碱性),环境pH值均高于细菌的等电点，使细菌NH3+电离受抑制而易于COO-电离，使细菌带负电荷。但是环境pH与G+菌的等电点差距大，故G+菌所带负电荷较G-菌多，其更易与带正电荷的结晶紫染料结合的牢固且不易脱色，从而G+菌被染成紫色。b.化学学说：G+菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫及碘的复合物牢固结合，使已着色的细菌不易被95%乙醇脱色；而G-菌含此物质少

7、，故易被乙醇脱色，再被稀释复红（沙黄）着色染成红色。c.渗透性学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚（1550层）并具有三维空间结构，脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。而G-菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层薄（12层）且无三维结构，脂质含量多，乙醇溶解脂质后已渗入细胞内，使结晶紫和碘复合物被溶出而脱色。d.综上所述：革兰阳性菌被染成紫色； 革兰阴性菌被染成红色。(2)步骤（经典）a.初染：在固定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液，染液的量最好覆盖整个菌膜，染色1min，用细流水从玻片的一端把游离的染液洗去，然后轻轻甩干玻片。b.媒染：滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，作用1min，用细流水冲洗，轻轻甩干

8、。可促使结晶紫与细菌结合更牢固。c.脱色：滴加95%乙醇数滴，轻轻摇动玻片，使之均匀脱色，然后左手斜持玻片，右手再滴加乙醇，直到流下的乙醇呈无色为止，约0.51.0min，用细流水冲洗，轻轻甩干。d.复染：加稀释复红染液（或沙黄）数滴，染0.5min1.0min，用细流水冲洗，用吸水纸吸干多余水分，或自然干燥。（3）BASO快速染色步骤a.加龙胆紫液染色10s，之后水洗，甩干。b.加碘溶液染色10s，之后水洗，甩干。c.加脱色剂脱色1020s，之后水洗，甩干。d.加沙黄溶液复染10s，之后水洗，用吸水纸吸干水分。 革兰染色经典和快速试剂组成的区别 经典 快速第1液 结晶紫和95%乙醇溶液 结晶

9、紫和95%乙醇溶液第2液 卢戈碘液 卢戈碘液第3液 95%乙醇 丙酮和95%乙醇溶液第4液 稀释石碳酸复红液 稀释沙黄染液 制片 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G”或“GN”（Grams Negative）表示。 【结果观察】1.将上述染过色已干燥的涂片置于载物台上，先用低倍镜找到要观察的视野，后滴加香柏油置油镜下观察，调大光圈使视野的光线相对强（将凹面镜换成平面镜）。细菌染成紫色为阳性，红色为阴性。2.同时还可观察细菌的形态、排列和大小等生物学特征。3.观察完后油镜镜头用擦镜纸滴上乙醚脱油擦净，显微镜放回原处。4.记录号菌： 号菌：【注意事项】1.操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时菌体过分受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。2.染液因素：防止染液蒸发改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后已失去媒染作用；涂片积水过多也会改变染液浓度；脱色剂以95%乙醇为好，浓度降低会减弱其脱色能力。3.细菌因素：细菌菌龄不同，染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色，而老龄菌被染成红色。一般以1824h的培养物染色效果好。4.每次实验完，值日生要把每一种染液瓶口用瓶盖拧紧，以防止染液的挥发和污染。【革兰染色的意义】1.细菌