实验四 细菌的鉴定技术-生物化学鉴定（二）

1、实验四 细菌的鉴定技术生物化学鉴定（二）1.触酶试验2.DNA酶试验3.血浆凝固酶试验4.杆菌肽敏感试验5.CAMP试验6.奥普托欣（Optochin）敏感试验7.胆汁溶菌试验8.胆汁-七叶苷试验9.6.5 %NaCl生长试验一、目的和要求 掌握与革兰阳性球菌鉴定有关的常用的生化反应的原理、操作方法和结果判定。二、器材与试剂1.菌种：号菌从病人标本中分离的金黄色葡萄球菌 号菌金黄色葡萄菌标准菌株ATCC25923 号菌某株-溶血性链球菌号菌肺炎链球菌 号菌肠球菌2.培养基：BA，DNA酶平板，40%胆汁-七叶苷微量培养基，6.5% NaCl微量血清肉汤培养基。3.试剂：生理盐水，3%双氧水，新

2、鲜的EDTA-K2抗凝的人血浆，0.04U/片杆菌肽纸片，5g/片的Optochin纸片，10%去氧胆酸钠溶液。4.其他器材：洁净玻片，无菌试管，小镊子，米尺，接种针，接种环，酒精灯等。三、试验的原理、方法及结果判定一）触酶试验（过氧化氢酶试验）1.原理 具有触酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态的氧，新生态的氧继而形成分子氧出现气泡。2.试剂 3%H2O2 溶液。3.方法 玻片法： 以无菌操作，用接种环取号菌少许分别依次涂布于一张洁净的玻片上，然后往每一种细菌上滴加3%H2O2 溶液1滴，立即观察结果，其中号为阳性对照。4.结果判定 于10s内迅速产生大量（丰富）气泡产生者且和号阳性对照菌

3、所产生的气泡一致（接近者）为阳性，不产生气泡者为阴性。5.注意事项：1）取菌落时，应该避免挑取培养基中的血琼脂，因为血液成分含触酶，易出现假阳性。2）取1824h生长的细菌，每次试验时应作阳性和阴性对照。3）肠球菌属某些种如粪肠球菌可呈弱阳性，有气泡产生但不丰富，视之为阴性。4）3%H2O2溶液要新鲜配制。6.应用：G+c初步鉴定重要的试验，葡萄球菌属和微球菌属阳性，而链球菌和肠球菌属的细菌则是阴性。7.质控菌：阳性菌：金黄色葡萄球菌，ATCC 25923；阴性菌：无乳链球菌，ATCC 13813。二）DNA酶试验1.原理 某些细菌所产生的DNA酶可使培养基中DNA长链水解成短链的寡核苷酸链。

4、DNA长链只能被酸沉淀，而水解后所形成的寡核苷酸链则可溶于酸。故在DNA琼脂平板上加入盐酸后，由于寡核苷酸链溶于酸，所以在菌落周围形成透明环。2.方法 在DNA平板上，以无菌操作将号菌、号菌ATCC25923作为阳性对照和号菌肠球菌作为阴性对照，分别点种或者密涂一小片，于35培养1824h后，用1mol/L盐酸倾注平板，立刻观察结果。3.结果 在菌落周围有透明环出现且和号菌所出现透明环一致或接近者为阳性，无透明环为阴性。4.应用 主要用于肠杆菌科及葡萄球菌属等某些菌种的鉴定。如沙雷菌属+，金黄色葡萄球菌+，卡他莫拉菌+。5.质控菌阳性菌：金黄色葡萄球菌，ATCC 25923；阴性菌： 粪肠球菌

5、，ATCC 29212。三）血浆凝固酶试验1.原理：金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细菌的细胞壁上（凝聚因子），它可以直接使血浆中的可溶性的纤维蛋白原变成不溶性的纤维蛋白而附着于细菌表面，在玻片上形成凝块；另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，其作用类似凝固酶原样物质，在血浆中的协同因子的激活下变为凝固酶样物质，此凝固酶样物质可使血浆中纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。 凝聚因子（结合凝固酶） 纤维蛋白原 纤维蛋白 凝固酶致活剂凝固酶原样物质 凝固酶样物质（游离凝固酶） 纤维蛋白原 纤维蛋白 2.试剂 新鲜的EDTA抗凝的家兔（人）血浆。3.方法1）玻

6、片法 于一张洁净玻片左、右两端各滴一滴生理盐水，用无菌操作以接种环挑去号菌置于左端生理盐水中，制成浓的均匀的菌悬液；再以无菌操作挑去号菌置于玻片右端的生理盐水中制成浓的均匀的菌悬液作阳性对照，两端的细菌必须无自凝现象，然后再分别滴加12滴新鲜血浆，双手拿着玻片的对角轻轻以一个方向摇动玻片，10s（2030s）观察结果。2）试管法：取洁净试管2支，分别取生理盐水2.0ml于两支试管中，一支以无菌操作取号菌数个菌落在较低液面管壁处充分研磨细菌做成菌悬液；另一支试管以无菌操作加入阳性对照菌数个菌落研磨混匀，然后向两支试管各加0.5ml血浆，混匀后于35 培养34h。4.结果判断1）玻片法：血浆中有明

7、显的细菌凝块并且和阳性对照菌所形成的凝块一致为阳性。若细菌在血浆中呈均匀混浊则为阴性。2）试管法：血浆凝固有明显的胶冻状纤维蛋白并和阳性对照菌所形成纤维蛋白胶冻块一致为阳性。反之，试管内血浆不凝固仍呈流动状，则为阴性。凝固酶试验的结果5.注意事项1）玻片法a.10s内观察结果，如超过10s可出现假阳性。b.路登葡萄球菌和施氏葡萄球菌的玻片法可出现阳性，必须用试管法验证游离凝固酶的存在。c.必须制备浓厚的均匀菌悬液。d.用EDTA抗凝的家兔血浆为最好，枸橼酸盐抗凝血浆会产生将阳性。e.菌悬液加入血浆后开始摇动玻片，计数时间，此时不可在研磨细菌了，以免细菌凝块分散变小。f.生长在高盐培养基上菌落可

8、出现自凝或假阳性。 2）试管法a.阳性者应见到明显的纤维蛋白凝块，倾斜试管其中的凝固物不移动。b.在34h观察效果最佳，时间太长，某些金黄色葡萄球菌可产生纤溶酶溶解试管内的纤维蛋白凝块，使其从胶冻状变成片状结构。c.血浆与生理盐水的比例是1:46.应用 用于葡萄球菌属间的鉴别。如金黄色葡萄球菌玻片法、试管法阳性。其他凝固酶阳性葡萄球菌有：玻片法：施氏葡萄球菌阳性，中间葡萄球菌21%79%阳性，路登葡萄球菌弱阳性；试管法：中间葡萄球菌阳性、猪葡萄球菌21%79%的阳性。其余称为凝固酶阴性的葡萄球菌。7.质控菌 阳性菌：金黄色葡萄球菌，ATCC 25923 阴性菌：表皮葡萄球菌四）杆菌肽敏感试验1

9、.原理 在溶血性链球菌中,A群中的化脓性链球菌对杆菌肽几乎全部（100%）敏感，而其他溶血性链球菌对其通常耐药。2.培养基 血琼脂平板。3.方法 将号菌以无菌操作用接种环直接均匀密涂于血琼脂平板上，将0.04U/片杆菌肽纸片用无菌小镊子贴于血琼脂平板上，贴完后用镊子轻压纸片一下，倒扣平板，35 培养1824h，观察结果。4.结果 用直尺量取抑菌环的直径，抑菌环直径10mm敏感，10mm为耐药。5.应用 用于A群化脓性链球菌与其他溶血性链球菌的鉴别。A群化脓性性链球菌对杆菌肽敏感，在涂布了该菌菌液的血平板上贴上杆菌肽，36培养1824h，如果有大于10mm的抑菌带出现即为阳性。 6.注意事项 1

10、）涂布接种细菌时，接种量应大，以免出现假阳性。2）放置杆菌肽纸片后应用镊子在纸片表面轻按使纸片同血平板表面紧密接触。7.质控菌阳性菌：化脓性链球菌，ATCC 19615。阴性菌：粪肠球菌，ATCC 29212；直接均匀密涂接种法 1.以无菌操作，用接种环挑起待测菌少许，在血平板上划十字或米字，接着进行密集重复的划线，划满整个平板。2.然后将BA旋转60做密集重复的划线。3.再将BA旋转60做密集重复的划线。4.最后用接种环沿培养基的内缘涂抹1圈。五）CAMP试验1.原理 在溶血性链球菌中，B群的无乳链球菌能产生“CAMP”因子，此因子可促进金黄色葡萄球菌-溶血素溶解红细胞的活性，因此在血琼脂平

11、板上可观察到两种细菌交界处的溶血能力增强，出现箭头状透明溶血区。（1944年Christis,Atkins和Munch-Peterson首先描述此现象，故称为“CAMP”因子）2.培养基 血琼脂平板。3.方法 先在血琼脂平板上以无菌操作用接种针将号菌金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 25923)划一横线，再将号菌与之作垂直划线接种，两菌划线不能相交连，在被检菌与金葡菌相距3mm处停下，用号菌做阴性对照，35 培养1824h。4.结果判断 在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性，否则为阴性。5.应用 在溶血性链球菌中，只有B群的无乳链球菌CAMP试验阳性，为其特异性鉴定。其他溶血性链球菌为阴性。

12、G+b中产单核李斯特菌CAMP试验也为阳性。6.质控菌 阳性菌 无乳链球菌，ATCC 13813，阴性菌 粪肠球菌，ATCC 29212。六）奥普托欣敏感试验1.原理 Optochin（乙基氢化羟基喹宁）能干扰肺炎链球菌叶酸的合成，从而可抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对Optochin敏感。而Optochin对其他链球菌则无抑制作用，其他链球菌表现为对其耐药。2.培养基 血琼脂平板。3.方法 将菌以无菌操作用接种环直接均匀密涂布于血琼脂平板上，无菌小镊子贴上一个5g/片的Optochin纸片，轻压纸片倒扣平板，35 、5%10%CO2环境培养1824h，观察抑菌环大小。4.结果 用直尺量取抑菌环

13、直径，抑菌环直径14mm敏感，推断为肺炎链球菌；抑菌环直径14mm为耐药，近年来发现对Optochin耐药的肺炎链球菌，须参照胆汁溶菌试验，若胆汁溶菌试验+则为肺炎链球菌，否则为其他草绿的链球菌。5.应用 用于肺炎链球菌与其他草绿色链球菌的鉴别。6.注意事项1）个别情况会出现草绿色链球菌对Optochin敏感及个别肺炎链球菌Optochin抑菌环直径14mm及耐药的情况，应联合使用多种方法共同检测，如参照胆汁溶菌试验，若胆汁溶菌试验+则为肺炎链球菌，否则为其他草绿的链球菌。2）将肺炎链球菌放在大气中培养则会成长不良出现较大的抑菌圈。6.质控菌 阳性菌 肺炎链球菌，ATCC 10015， 阴性菌

14、 化脓性链球菌，ATCC 19615. 七）胆汁溶菌试验1.原理 胆汁或胆盐（去氧胆酸钠和牛黄胆酸钠）能活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌细胞膜破损或菌体裂解而自溶。2.试剂 10%去氧胆酸钠3.方法 平板法 于号菌落上加数滴10%去氧胆酸钠溶液，35 孵育1530min。4.结果判断 平板上若菌落消失仅留下草绿色溶血环为阳性，菌落不消失为阴性。5.注意事项 应注意观察被检菌是真正的溶解还是被试剂冲走移位。6.应用 用于肺炎链球菌与其他草绿色链球菌的鉴别。八）胆汁-七叶苷试验1.培养基 （40%）胆汁-七叶苷微量培养基2.原理 培养基中的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七

15、叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌和D群链球菌都能在含有胆汁的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe2+反应形成黑色沉淀，使培养基由无色变黑色。3.方法 以无菌操作用接种针挑取少量号菌接种于上述培养基中，35 培养1824h。4.结果判断 有细菌生长，且培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变为阴性。5.注意事项 细菌接种量不宜过大，若过大细菌不需要耐受生长而本身固有的酶足以使七叶苷分解，出现假阳性。6.应用 鉴定肠球菌的重要试验，但不能区分D群链球菌与肠球菌。7.质控菌阳性菌：粪肠球菌，ATCC 29212；阴性菌：化脓性链球菌，ATCC 19615。九）6.5% NaCl生长试验1.培养基 6.5% NaCl微量血清肉汤培养基。2.原理 肠球菌具有很强的耐盐能力，能在上述培养基生长，并且分解培养基中的葡萄糖产酸，使指示剂溴甲酚紫由淡紫色变黄色。而链球菌的耐盐能力较弱，在此培养基不能生长。3.方法 以无菌操作用接种针取少许号菌接种于上述培养基中，35 培养1824h。4.结果判断 细菌生长且使培养基变黄为阳性，细菌不生长颜色不变者为阴性。5.注意事项 细菌接种量不易过大，否则细菌并不需要耐受繁殖即可直接使葡萄糖产酸导致假阳性。6.应用 是鉴别肠球菌（+）和D群链球菌