细菌分离纯化及鉴定protocol

1、细菌分离纯化培养及鉴定protocol样品菌株分离：准备工作1用报纸将平板包好（约12个一包）灭菌后放入烘箱烘干，最好隔 夜；2按照培养基的配方配制好液体培养基后，调pH值（注意灭菌后培 养基pH会略有升高），其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼 脂后，倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量 不能超过锥形瓶的三分之二，约一半左右；剩余液体培养基加入 试管中，每支5ml （其中3ml用于保种，2ml用于提取菌株基因组 DNA），用胶塞封好，与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌；3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟，将灭好菌的培养基放置 冷却到不烫手后，在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中

2、，每 块板中倒入约20ml，厚度约为培养皿的1/31/2之间。倒好后的 培养皿叠放在超净台内，待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使 用。暂时不用的，可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称，标注日期，姓名。用枪加入100uL液 体样品到培养皿上，尽量把培养皿托平，将涂布玻棒插入酒精中 取出在酒精灯外焰灼烧完全，待冷却后，在酒精灯下将液体涂布 均匀（最好涂布至培养基将液体全部吸收）。5将涂好的培养皿正置培养2小时后，用封口膜封好，倒置培养。定时观察平板，描述菌落的颜色、形状，记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化：1待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用挑取同一培养皿中不同颜 色

3、、不同形状的菌落进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标 出。2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全，稍冷却后，在平板上进行Z字 形三个方向划线。3若在新板上又长出新菌落，再次分离划线4划线需做至少2-3次，直至菌落完全纯化（纯化步骤很关键）保种：1将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内（注意要取单菌落），摇床150r/min, 28C培养，直到其生长至指数期2在2ml冻存管（预先灭菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油预先 配置好灭菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，盖紧管盖，混 匀后在管壁做好样品标记和日期，同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管，做好记录，放入冷存盒，放入-80度冰

4、箱内， 记录存放位置。4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中 待提取DNA。DNA的提取：可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行 手提法步骤如下：1、取2mL,8000r/min离心10分钟，弃去上清。2、加入2 ml无菌水离心洗涤两次，用2ml无菌水悬浮菌体，混 匀,-20C保存备用。3、取 0.7ml 菌悬液，加入 37 口 l 10%SDS,混匀，加入 7.4 口 l 10mg/ml 蛋白酶K,混匀，37T温育1小时4、加入 148 口 l 5mol/L NaCl,再加入 102 口 l CTAB/NaCl （质量浓度50 g/ L CTAB ,0.5

5、mol/ L NaCl），混匀，65C温育 10 分钟。5、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟,保留上 清。6、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1）,混 匀,10000r/min离心5分钟，保留上清。7、加入0.6倍的异丙醇，混匀,-20C静置20分钟以上，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。8、用50 口 l无菌水溶解DNA,4C保存。比较了几种方法，该方法对我们实验室的纯菌DNA的提取较好，能提 到较高浓度的DNA。16S PCR反应及其测序：将已提取的细菌基因组DNA作为模板，1492r, 27f作为引物，用TAKARA高保真taq酶做16s PCR反应，其PCR产物纯化（纯化试 剂盒）后，即可送去测序；也可以将产物直接拿给测序公司由他们帮 忙纯化并测序，其费用会略高