微生物实验室sop

1、.：.；临床微生物学检验(sop)高压锅运用的规范操作程序SOP实验室称号工程 编号制定日期*高压锅的运用*年*月*日【目的】确保高压效果的可靠性。【适用范围】蒸气式高压锅。【该SOP变动程序】 本规范操作程序的改动，可由任一运用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【操作方法】将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，封锁锅门，拧紧螺丝并确认曾经封锁。翻开排气阀。翻开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。察看排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表到达0.05mPa时，封锁排气阀。察看压力表，当压力升至0.15mPa时，开场计时。压力

2、达0.15mPa后，可调理进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在0.15mPa。电加热时，可切断电源，维持压力继续15分钟，至多不超越30分钟，否那么营养物质破坏。封锁进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上翻开排气阀，以免发生不测。待锅内压力降为零时，可翻开锅盖，取出物品。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * *日期 *年*月*日培育箱运用的校准规范操作程序SOP实验室称号工程编号制定日期*培育箱运用、维护与校准*年*月*日【目的】 确保培育箱温度恒定。【适用范围】 各种类型隔水式、温度设定为27、35、42、56培育箱。【该SOP变动程序】 本规范操作程序的改动，可由任一运

3、用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【操作方法】培育箱应放置于程度地面或巩固的程度台，电源电压须匹配。从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。将温度调理旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开处。每次运用时应在培育箱顶部插入规范温度计，监测实践温度。培育箱任务温度动摇范围应控制在10C以内。培育箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。培育箱内外应坚持清洁。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * *日期 *年*月*日 培育基制备的规范操作程序SOP实验室称号工程编号制定日期*培

4、育基的制备*年*月*日【目的】保证培育基的质量。【适用范围】运用废品培育基干粉制备各种分别培育基。【该SOP变动程序】本规范操作程序的改动，可由任一运用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【步骤】1.在玻璃容器中参与所需蒸馏水的二分之一量，然后放入一定量培育基干粉，补足水量，悄然搅拌以促进溶解。2.校正pH：高压灭菌前可用pH计或精细pH试纸校正培育基的pH。3.分装：液体培育基普通在灭菌前分装，分装时应留意每管的分装量不应高于试管的2/3。琼脂平板是在培育基高压灭菌后冷至50-600C时再倾注平板。4.质量检查1 无菌实验：将制好的培育基在350C孵育过夜，断定

5、能否灭菌合格。2 效果检验：按不同的培育要求，接种相应的菌种，察看细菌的发育、菌落形状、色素、溶血等特征，判别培育基能否符合要求。5.保管：液体培育基及琼脂平板须在40C保管，普通不超越7天，如用塑料袋密封至多保管2周。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * * 日期 *年*月*日 革兰染色的规范操作程序实验室称号 工程 编号制定日期*革兰染色*年*月*日【目的】确保染色结果明晰可靠。【该SOP变动程序】本规范操作程序的改动，可由任一运用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【试剂】1.结晶紫溶液A液：结晶紫 2g 95%乙醇 20ml液：草酸铵 0.8g 蒸馏

6、水 80ml运用前24小时将A液液混合后，过虑后装入试剂瓶内备用。2.碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300ml3.脱色液：95%乙醇4.复染液储存液：沙黄 2.5g 95%乙醇 100ml运用液：储存液 10ml 蒸馏水 90ml【方法】1.待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然枯燥或火焰固定。2.加结晶紫液染1分钟，清水冲去染液。3.加碘液染1分钟，清水冲去染液。4.加95%乙醇脱色液，不时摇动约10-30分钟，至紫色已零落为至，水冲洗。5.加复染液伊红，染30分钟，水冲洗。6.待涂片自然枯燥后，油镜镜检。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * *日期 *年*月*日 抗酸染色的规范操作程序

7、实验室称号工程编号制定日期*抗酸染色*年*月*日【目的】确保染色结果明晰可靠。【方法】碱性复红染色法【试剂】1、萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液 10ml5%石炭酸溶液 90ml2、脱色剂浓盐酸 3ml95%乙醇 97ml3、复染液吕弗勒美蓝液美蓝乙醇饱和溶液 30ml10%氢氧化钾 0.1ml蒸馏水 100ml【染色步骤】涂片经自然枯燥或火焰固定后，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5分钟假设染色奴卡菌需求加长时间，水洗。加脱色剂，不时摇动坡片至无红色零落为至，水洗。加复染液，染0.5-1分钟。干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。注：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色

8、剂改用2%硫酸水溶液。二金胺O-罗丹明染色法【染剂】罗丹明液：罗丹明 0.1g加蒸馏水100ml；0.1%金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml，再参与纯石炭酸5ml，混匀。3%盐酸酒精。稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。【方法】1、涂片固定后加第1液30-90分钟。2、弃去第1液后加第2液染15分钟。3、用第3液脱色1-2分钟，水洗。4、滴加第4液染30分钟，水洗，待干，荧光镜检。【结果】抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * * 日期 *年*月*日 血培育标本采集的规范操作程序实验室称号工程编号制定日期*血培育标本的采集*年*

9、月*日【目的】指点血液标本的正确采集。【该SOP变动程序】本规范操作程序的改动，可由任一运用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【步骤】1.选择一适当的静脉穿刺处，先以70%酒精擦拭。2.再用棉签沾取2%碘酊涂于欲作静脉穿刺处，让其干后再用70%酒精擦拭。3.全部手续再作一此如必要4.用一支无菌的21号针头与10ml针筒抽空成人约抽取10ml血液，小孩约抽取1-5ml。5.血液抽出后，立刻注入血液培育瓶，马上充分混匀后，再送入检验。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * *日期 *年*月*日 血液及骨髓微生物学检验的规范操作程序SOP实验室称号工程编号制定日期

10、*血液及骨髓微生物学检验*年*月*日【目的】保证血骨髓培育结果的正确性。【该SOP变动程序】本规范操作程序的改动，可由任一运用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【实验条件】培育箱或厌氧培育箱或厌氧罐或全自动血培育仪。【操作程序】标本采集严厉无菌技术取血液10ml儿童血液1-5ml、骨髓0.5-1 ml注入血培育瓶后立刻送实验室，注入厌氧瓶时要留意勿将注射器内的空气注入瓶内，培育瓶在送实验室前，不可放冰箱暂存。培育1.实验室接到血培育瓶后，放350C孵育。2.经过12-18小时，350C孵育后，在血平板或巧克力平板上盲传一次。3.盲传后继续孵育，每日早晨察看有无细

11、菌生长，直至第7天。4.无细菌生长表现的培育瓶，在察看的7天中，最少应做2次盲目传种。5.全自动血培育仪培育时，待其仪器报警，涂片、接种；假设仪器未报警，5天后盲种，仍为阴性，才干报告。分别鉴定1.盲传阳性或肉眼可见生长景象，直接涂片做革兰染色，所见结果应及时报告临床医师。2.根据涂片结果，如为一种细菌生长，那么直接以增菌液做鉴定实验；如有两种或多种细菌同时生长，那么必需经过分别培育，以获得纯菌种后做鉴定。3.细菌鉴定要做到种的鉴定。药敏实验1.根据涂片结果，直接以培育瓶内的增菌液做直接药物敏感性测试，争取在较短时间内得出初步结果，供临床医师作为治疗的参考。2.标本经平板分别纯培育后，做规范化

12、药敏实验正式报告给临床。【结果的判别】1.疑有细菌生长者，经涂片、革兰染色镜检后，通知主管医师。2.任何时候平板上长出单个菌落，应立刻完成鉴定就及规范化药敏实验，并发出报告，报告方式为“XXX细菌生长，药敏实验报告方式为“XXX敏感等。3.培育3天为阴性的标本，应通知临床医师，培育7天仍为阴性者，应报告“经7日培育无细菌生长。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * *日期 *年*月*日保证质量评价的准确可靠。【作用】 药敏实验的规范操作程序实验室称号工程编号制定日期*药敏实验*年*月*日一、KB法【目的】保证纸片分散法药敏结果的可靠性。【资料】培育基Mueller-Hinton琼脂平板，只

13、适宜肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；HTM琼脂，只适宜嗜血杆菌；GC琼脂1特定的生长因子，只适宜淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂5羊血，只适宜链球菌。药敏纸片抗菌药物纸片直径约为6.0-6.35mm，每片的吸水量约20ml。质控菌株K-法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。四菌液比浊管接种菌液浓度为1.5x108/ml，相当于0.5的麦氏比浊管。【方法】1.制备接种菌液：挑选琼脂平板上，形状一样的菌落移种于M-H液体培育基中，置350C温箱中孵育4小时，校正浊度，或用接中

14、环挑取菌落，置浮于生理盐水中振荡混匀后与规范化浊管比浊，调整浊度与比浊管一样。2.接种平板：用无菌棉签蘸取已制备好的接种好的菌液，在管壁上旋转挤压九次，去掉过多的菌液，涂布整个M-H培育基外表，并将平板旋转60，反复几次，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。3.贴纸片：待平板上的水分被琼脂完全吸收后约15分钟，用无菌镊子取纸片贴在琼脂平板外表，并用镊尖轻压一下，使其贴平。每张纸片间距不 少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。4.孵育：把贴好药敏纸片的平皿放进350C孵平板，最好单独摆放，不超越2个叠在一同，孵育18-24小时后，读取结果。5.断定结果：培育后取出平板，用游标卡尺丈量抑

15、菌环的直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，然后根据抑菌环直径大小、NCCLS判别细菌的敏感性，并加以记录。二、稀释实验【目的】1.为了决议抗生素的最低抑菌浓度MIC。2.为了决议抗生素杀菌才干，或实验两种以上抗生素对细菌的协同作用或对抗作用。【方法】肉汤稀释实验1.适用情况：1 血液培育。2 病人对适当治疗方法无效。3 免疫机能妨碍病人4 病人经治疗后复发者。2.培育基的选择：普通细菌用调理好阳离子的M-H肉汤CAMHB，如肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；某些挑剔性细菌那么根据其生长的营养需求，向M-H肉汤中参与适当的营养物进展实验，如HTM肉汤，只适

16、宜嗜血杆菌；CAMHB25冻融马血，适宜肺炎链球菌以及以外的链球菌。3. 肉汤的延续稀释：1 将各种抗微生物药物库存液稀释成200ug/ml或200u/ml。2 取10支无菌试管，写上编号1-10，为一组每种抗生素需一种。3 自第2管至10管各参与无菌肉汤1。04 将各实验药分别加1.0ml至第1管及第2管，将第2管混匀后移取0.1ml至第3管，同样操作，倍比稀释至第9管，第10管不加抗生素作为阳性生长对照。5 另外预备仅含肉汤的试管，作为阴性对照。4.细菌的接种1 每支试管接种1.0ml菌液约105-106个细菌/ml，也可将细菌调至0.5个麦氏浊度再用肉汤稀1：200然后接种1.0ml至每

17、支试管内。2 接种后每支试管含混合液，抗生素浓度为512ugu-O.125ugu。3 假设细菌对某种抗生素特别敏感，可把操作液先稀释10倍，再予延续2倍稀释，最后的浓度为10；5；2.5；0.6；0.3；0.15；0.08；及0.04ug/ml。5.培育和结果的判别在350C温箱中培育16-20小时后，肉眼察看生长情况，阳性对看管可见浑浊生长，阴性对看管那么应清澈。 以抗生素能抑制细菌生长管的最低浓度为其MIC值。6.丈量最低杀菌浓度MBC把无菌生长的每一试管吸0.1ml加到500C的胰蛋白胨肉汤Tryptic soy broth,TSA20ml混合均匀后分别倒平板，培育48-72小时后计算菌

18、落数，和1：200稀释原菌液作倾注获得的细菌数相比，减少99.9，其最小抑菌浓度为可得到抗生素的MBC值。普通在实践运用中，采用定量接种环0.001毫升涂化平板，孵育后，平板菌落计数小于5个，其抑菌浓度为最小杀菌浓度。7.质控：利用NCCLS建议的规范菌株进展质控。微量肉汤稀释敏感实验手工法：原理与试管稀释方法一样。详细操作是在含有96小孔的小塑料培育盘进展，每一孔可装0.1ml量，每一盘可同时作数种抗生素的数种不同浓度，另2孔作为阳性与阴性对照。仪器法：配制仪器Minidiluter或MIC-2000美国Dynatech labortories，Alexandria，VA自配或购买现成的实验

19、培育基。琼脂稀释法1此法与肉汤稀释实验原理一样，但又有其优点：可同时实验许多菌株，利用多点接种仪可同时接种多个菌株到一系列含有各种不同抗生素浓度的平板。可检测能否污染：由细菌在平板上生长的特性判别。可对肉汤稀释实验结果不佳的挑剔性细菌进展实验。2.琼脂培育基的选择：普通运用M-H琼脂，它适宜肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；对挑剔的细菌可参与相应的营养物，如巧克力、动物血、5%脱纤维血或冷冻动物血等，如HTM琼脂，只适宜嗜血杆菌；GC琼脂1特定的生长因子，只适宜淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂5羊血，只适宜肺炎链球菌以外的链球菌。3.抗生素稀释与平板的配

20、制。4.平板的接种：1 每一实验菌株需调整浓度至0.5麦氏浊度。2 平板点接种可用定量接种杯0.001ml、毛细吸管或自动接种仪器进展。同时作5个对照菌株作为质控：大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212。5.待接种菌液被完全吸收后，倒置培育在350C温箱内。6.结果的判别：16-20小时后，首先看不含抗生素的对照平板，必需有一株生长，然后看各实验平板，凡能完全抑制细菌生长的抗生素最低浓度即为MIC值。操作人员 部门主管 质量担任人姓名 * * *日期 *年*月*日 药敏实验室内质量控制的规范操作实验室称号工程编号

21、制定日期*药敏实验室内质量控制*年*月*日【目的】保证药敏报告的准确性，可靠性及重现性。【该SOP变动程序】本规范操作程序的改动，可由任一运用本SOP的任务人员提出，并报经下述人员同意签字：专业主管、科主任。【适用范围】琼脂纸片分散法。【方法】一、培育基纸片分散实验必需运用M-H琼脂培育基，由于它不含抑制磺胺药物，而其他种类培育基能够含有与磺胺药拮抗的物质，使其抑菌环变小。1.培育基的制造过程必需一致，无论是培育基或添加物的剂量、PH值、高温灭菌的时间或温度都需遵照规定，2.新的粉状脱水培育基翻开时，要附厂商、编号、日期、及翻开者的姓名。3.无菌实验：每一批配好的培育基其中抽取5%的量在 35

22、0C或其他适宜的温度下隔夜培育，察看有无菌落生长。4.假设是新购的培育基必需察看其颜色与透明度，假设有沉淀、浑浊或脱水的景象都必需丢弃，新配好的M-H培育基，用塑料袋包好，贮藏于40C的水箱内，防水蒸发。5.平板所含培育基的量太多或太少均不宜，如MuellerHinton agar的高度不可超越4mm，否那么会影响抑菌环的直径变小。6.定期检测培育基的有效性，并对结果加以记录，以便能随时发现问题。7.培育基要在有效期内运用。二、试剂 鉴定细菌实验所用的纸条或纸片，贮藏于冰箱时，须附枯燥剂，且须留意所标明的有效期限。纸片购入时须作阳性与阴性对照以检查其能否有效，以后可每周做一次。三、抗生素粉末与

23、抗生素纸片 检查室诊断过程中所用抗生素粉末必需坚持枯燥，置冰箱贮藏，假设其制成高浓度的库存溶液，应该采取少量分装于各小瓶，储存于-140C或-140C以下，一旦取出解冻，未用完的就应丢弃。假设抗生素粉末用于稀释实验时，须限知MIC的微生物作对照。 作药敏用的抗生素纸片应放枯燥剂并储存于-140C或-140C以下，假设情况不允许，除了penicillins、cephalosporins及oxacillin纸片仍必需冰冻外，其他可置冰箱储存。从冰箱取出装抗生素纸片的容器，须待其复温至室温后才干翻开运用。 每天在作药敏实验时，最好同时取知敏感的微生物质控菌株作对照，来检验纸片的效果。四、配备培育箱、冰箱等配备于每天早上上班时须记录温度并校正，运用过程中应留意温度有无变化。CO2 培育箱，要确保其所含的CO2量。厌氧缸在运用时，催化剂要先在1600C枯燥箱中加热1-2小时，使其恢复功能，且同时于缸中放入生物指示剂可确定能否绝对无氧。五、操作人员素质操作者应熟习药敏实验的规范步骤，尤其要留意其影响要素，如：接种菌的浓度不能太高或太低，应规范化；接种要用无菌棉拭子，不可用接种针或接种环，且要使接种