王镜岩生物化学笔记整理版

1、.：.；王镜岩 生物化学 笔记 整理版第一章 蛋白质化学教学目的：1.掌握蛋白质的概念、重要性和分子组成。2.掌握-氨基酸的构造通式和20种氨基酸的称号、符号、构造、分类；掌握氨基酸的重要性质；熟习肽和活性肽的概念。3.掌握蛋白质的一、二、三、四级构造的特点及其重要化学键。4.了解蛋白质构造与功能间的关系。5.熟习蛋白质的重要性质和分类导入：100年前，恩格斯指出“蛋白体是生命的存在方式；今天人们如何认识蛋白质的概念和重要性？ 1839年荷兰化学家马尔德G.J.Mulder研讨了乳和蛋中的清蛋白,并按瑞典化学家Berzelius的提议把提取的物质命名为蛋白质Protein，源自希腊语，意指 “

2、第一重要的 。德国化学家费希尔(E.Fischer)研讨了蛋白质的组成和构造，在1907年奠立蛋白质化学。英国的鲍林(L.Pauling)在1951年推引出蛋白质的螺旋；桑格(F.Sanger)在1953年测出胰岛素的一级构造。佩鲁茨(M.F.Perutz)和肯德鲁(J.C.kendrew) 在1960年测定血红蛋白和肌红蛋白的晶体构造。1965年，我国生化学者首先合成了具有生物活性的蛋白质胰岛素insulin。 蛋白质是由L-氨基酸经过肽键缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子biomacromolecule。蛋白质是生命活动所依赖的物质根底，是生物体中含量最丰富的大分子。单

3、细胞的大肠杆菌含有3000多种蛋白质，而人体有10万种以上构造和功能各异的蛋白质，人体干重的45%是蛋白质。生命是物质运动的高级方式，是经过蛋白质的多种功能来实现的。新陈代谢的一切的化学反响几乎都是在酶的催化下进展的，已发现的酶绝大多数是蛋白质。生命活动所需求的许多小分子物质和离子，它们的运输由蛋白质来完成。生物的运动、生物体的防御体系离不开蛋白质。蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起着重要的作用。随着蛋白质工程和蛋白质组学的兴起和开展，人们对蛋白质的构造与功能的认识越来越深化。第一节 蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成经元素分析，主要有 C50%5

4、5%、H6%7%、O19%24%、N13%19%、S0%4%。有些蛋白质还含微量的P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I等。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。因此，可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量。 每克样品含氮克数6.25100=100g样品中蛋白质含量g%二、蛋白质的根本组成单位氨基酸蛋白质在酸、碱或蛋白酶的作用下，最终水解为游离氨基酸amino acid，即蛋白质组成单体或构件分子。存在于自然界中的氨基酸有300余种，但合成蛋白质的氨基酸仅20种称编码氨基酸，最先发现的是天门冬氨酸1806年，最后鉴定的是苏氨酸1938年。一氨基酸的构造通式组成蛋白质的20种氨基酸有共同

5、的构造特点：1氨基衔接在- C上，属于-氨基酸脯氨酸为-亚氨基酸。2R是側链，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的氨基酸都是L-型。 留意：构型是指分子中各原子的特定空间排布，其变化要求共价键的断裂和重新构成。旋光性是异构体的光学活性，是使偏振光平面向左或向右旋转的性质，-表示左旋，+表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。二氨基酸的分类1按R基的化学构造分为脂肪族、芳香族、杂环、杂环亚氨基酸四类。2按R基的极性和在中性溶液的解离形状分为非极性氨基酸、极性不带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。 带有非极性R烃基、甲硫基、吲哚环等，共9种：甘Gly、丙Ala、缬

6、Val、亮Leu、异亮Ile、苯丙Phe、甲硫Met、脯Pro、色Trp 带有不可解离的极性R羟基、巯基、酰胺基等，共6种：丝Ser、苏Thr、天胺Asn、谷胺Gln、酪Tyr、半Cys带有可解离的极性R基共5种：天Asp、谷Glu、赖Lys、精Arg、组His，前两个为酸性氨基酸，后三个是碱性氨基酸。蛋白质分子中的胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合而成，胶原蛋白中的羟脯氨酸、羟赖氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白质加工修饰而成。三氨基酸的重要理化性质 1普通物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点普通在200 oC以上。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大酪氨酸不溶于水。普通溶解于稀酸或稀碱，但不能

7、溶解于有机溶剂，通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。芳香族氨基酸Tyr、Trp、Phe有共轭双键，在近紫外区有光吸收才干，Tyr、Trp的吸收峰在280nm，Phe在265 nm。由于大多数蛋白质含Tyr、Trp残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。2两性解离和等电点isoelectric point, pI 氨基酸在水溶液或晶体形状时以两性离子的方式存在，既可作为酸质子供体，又可作为碱质子受体起作用，是两性电解质，其解离度与溶液的pH有关。 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH

8、称为该氨基酸的等电点。氨基酸的pI是由-羧基和-氨基的解离常数的负对数pK1和pK2决议的。计算公式为：pI=1/2(pK1+ pK2)。假设1个氨基酸有3个可解离基团，写出它们电离式后取兼性离子两边的pK值的平均值，即为此氨基酸的等电点酸性氨基酸的等电点取两羧基的pK值的平均值，碱性氨基酸的等电点取两氨基的pK值的平均值。3氨基酸的化学反响 氨基酸的化学反响是其基团的特征性反响。重要的有：1茚三酮反响 一切具有自在-氨基的氨基酸与过量茚三酮共热构成蓝紫色化合物脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反响产生黄色物质。用分光光度法可定量测定微量的氨基酸。蓝紫色化合物的最大吸收峰在570nm波优点，黄色在440

9、nm波长下测定。吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。 2与2，4-二硝基氟苯DNFB的反响 在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与DNFB作用生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨基酸DNP-氨基酸，这一反响在蛋白质化学的研讨史上起过重要作用，Sanger等人运用它测定胰岛素一级构造。多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的，即利用多肽链N端氨基酸的-氨基与异硫氰酸苯酯PITC反响Edman降解法。三、肽peptide1肽键与肽链一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水构成的酰胺键称为肽键。由氨基酸经过肽键相连而成的化合物称为肽。肽键及其两端的-碳原子相连所构成的长链骨架，即CCNCCNC

10、CNC称为多肽主链，CCN是反复单位。肽键是蛋白质分子中的主要共价键。多肽链的方向性是从N末端指向C末端。肽分子中不完好的氨基酸称为氨基酸残基。肽按其序列从N端到C端命名。普通10肽以下属寡肽，10肽以上为多肽。2生物活性肽1谷胱甘肽glutathione，GSH是由Glu、Cys、Gly组成的一种三肽，又叫-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸含-肽键。Cys的-SH是主要功能基团，GSH是一种抗氧化剂，是某些酶的辅酶，可维护蛋白质分子中的-SH免遭氧化，维护巯基蛋白和酶的活性。在GSH过氧化物酶的作用下，GSH复原细胞内产生的H2O2，生成H2O，2分子GSH被氧化成GSSG，后者在GSH复原酶催化下，又

11、生成GSH。 2多肽类激素和神经肽人体内有许多激素属寡肽或多肽，如下丘脑垂体分泌的催产素9肽、加压素9肽、促肾上腺皮质激素ACTH，39肽等。催产素和加压素构造仅第3、第8位两个氨基酸残基不同，前者使平滑肌收缩，有催产和使乳腺泌乳的作用；后者能使小动脉收缩，增高血压，也有减少排尿的作用。神经肽是在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。如脑啡肽5肽、-内啡肽31肽、强啡肽17肽等。随着脑科学的开展，会发现更多的生物活性肽。第二节 蛋白质的分子构造蛋白质是生物大分子，构造比较复杂，人们用4个层次来描画，包括蛋白质的一级、二级、三级和四级构造。一级构造描画的是蛋白质的线性或一维构造，即共价衔接的氨基酸

12、残基的序列，又称初级或化学构造。二级以上的构造称高级构造或构象conformation。一、蛋白质的一级构造primary structure1953年，英国科学家F. Sanger首先测定了胰岛素insulin的一级构造，有51个氨基酸残基，由一条A链和一条B链组成，分子中共有3个二硫键，其中两个在A、B链之间，另一个在A链内。蛋白质的一级构造测定或称序列分析常用的方法是Edman降解和重组DNA法。Edman降解是经典的化学方法，比较复杂。首先要纯化一定量的待测蛋白质，分别作分子量测定、氨基酸组成分析、N-末端分析、C-末端分析；要运用不同的化学试剂或特异的蛋白内切酶水解将蛋白质裂解成大小

13、不同的肽段，测出它们的序列，对照不同水解制成的两套肽段，找出重叠片段，最后推断蛋白质的完好序列。重组DNA法是基于分子克隆的分子生物学方法，比较简单而高效，不用先纯化该种蛋白质，而是先要得到编码该种蛋白质的基因DNA片段，测定DNA中核苷酸的序列，再按三个核苷酸编码一个氨基酸的原那么推测蛋白质的完好序列。这两种方法可以相互印证和补充。目前，国际互联网蛋白质数据库已有3千多种一级构造清楚。蛋白质一级构造是空间构造和特异生物学功能的根底。二、蛋白质的二级构造secondary structure蛋白质的二级构造是指其分子中主链原子的部分空间陈列，是主链构象不包括侧链R基团。构象是分子中原子的空间陈

14、列，但这些原子的陈列取决于它们绕键的旋转，构象不同于构型，一个蛋白质的构象在不破坏共价键情况下是可以改动的。但是蛋白质中任一氨基酸残基的实践构象自在度是非常有限的，在生理条件下，每种蛋白质似乎是呈现出称为天然构象的单一稳定外形。20世纪30年代末，L.Panling 和R.B.Corey运用X射线衍射分析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体构造，获得了一组规范键长和键角，提出了肽单元peptide unit的概念, 还提出了两种主链原子的部分空间陈列的分子模型-螺旋和-折叠。1肽单位 肽键及其两端的-C共6个原子处于同一平面上，组成了肽单位所在的平面称肽键平面。肽键CN键长为0.132nm，比相邻的单

15、键0.147nm短，而较C=N双键0.128nm长，有部分双键的性质，不能自在旋转。肽键平面上各原子呈顺反异构关系，肽键平面上的O、H以及2个-碳原子为反式构型trans configuration。主链中的CC和CN单键可以旋转，其旋转角、决议了两个相邻的肽键平面相对关系。由于肽键平面的相对旋转，使主链可以以非常多的构象出现。现实上，肽链在构象上遭到很大限制，由于主链上有1/3不能自在旋转的肽键，另外主链上有很多侧链R的影响。蛋白质的主链骨架由许多肽键平面衔接而成。2.-螺旋(-helix) -螺旋是肽键平面经过-碳原子的相对旋转构成的一种严密螺旋环绕，是有周期的一种主链构象。其特点是： 螺

16、旋每转一圈上升3.6个氨基酸残基，螺距约0.54nm每个残基上升0.15nm，旋转100O。 相邻的螺圈之间构成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。典型-螺旋一对氢键O与N之间共有13个原子3.613，前后间隔3个残基。螺旋的走向绝大部分是右手螺旋，残基侧链伸向外侧。R基团的大小、荷电形状及外形均对-螺旋的构成及稳定有影响。3.-折叠(-pleated sheet) -折叠是一种肽链相当伸展的周期性构造。 相邻肽键平面间折叠成110O角，呈锯齿状。 两个以上具-折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行陈列，构成-折叠片层，其稳定要素是肽链间的氢键。 逆向平行的片层构造比顺向平行的稳定。-螺旋和

17、-折叠是蛋白质二级构造的主要方式。毛发中的-角蛋白和蚕丝中的丝心蛋白是其典型，在许多球蛋白中也存在，但所占比例不一样。胶原蛋白中存在的螺旋构造不同于普通的-螺旋，是由3条具有左手螺旋的链相互缠绕构成右手超螺旋分子。链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向环绕维持其稳定性。4-转角-turn为了紧紧折叠成球蛋白的严密外形，多肽链180O回折成发夹或-转角。其处由4个延续的氨基酸残基构成，常有Gly和Pro存在，稳定-转角的作用力是第一个氨基酸残基羰基氧O与第四个氨基酸残基的氨基氢H之间构成的氢键。-转角常见于衔接反平行-折叠片的端头。5无规卷曲random coil多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲。典型球

18、蛋白大约一半多肽链是这样的构象。6超二级构造和构造域超二级构造和构造域是蛋白质二级至三级构造层次的一种过渡态构象。超二级构造指蛋白质中两个或三个具有二级构造的肽段在空间上相互接近，构成一特殊的组合体，又称为模体motif。通常有，等，例如钙结合蛋白质中的螺旋-环-螺旋模序及锌指构造。构造域是球状蛋白质的折叠单位，是在超二级构造根底上进一步绕曲折叠有独特构象和部分生物学功能的构造。对于较小的蛋白质分子或亚基，构造域和三级构造是一个意思，即这些蛋白质是单构造域的；对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上的相对独立的构造域缔合成三级构造。三、蛋白质的三级构造tertiary struc

19、ture指一条多肽链中一切原子的整体排布，包括主链和侧链。维系三级构造的作用力主要是次级键疏水相互作用、静电力、氢键等。在序列中相隔较远的氨基酸疏水侧链相互接近，构成“洞穴或“口袋状构造，结合蛋白质的辅基往往镶嵌其内，形胜利能活性部位，而亲水基团那么在外，这也是球状蛋白质易溶于水的缘由。1963年Kendrew等从鲸肌红蛋白的X射线衍射图谱测定它的三级构造153个氨基酸残基和一个血红素辅基，相对分子质量为17800。由AH 8段-螺旋环绕折叠成球状，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部构成一个袋形空穴，血红素居于其中，富有极性及电荷的那么在分子外表构成亲水的球状蛋白。四、蛋白质的四级构造 (q

20、uaternary structure)有些蛋白质的分子量很大，由2条或2条以上具有独立三级构造的多肽链经过非共价键相互结合而成，称为蛋白质的四级构造。构成四级构造的每条多肽链称为亚基 (subunit)，亚基单独存在时普通没有生物学功能，构成四级构造的几个亚基可以一样或不同。如血红蛋白(hemoglobin,Hb) 是由两个-亚基和两个-亚基构成的四聚体22。五、蛋白质分子中的化学键蛋白质的一级构造是由共价键构成的，如肽键和二硫键。而维持空间构象稳定的是非共价的次级键。如氢键、盐键、疏水键、范德华引力等。第三节 蛋白质构造与功能的关系一、蛋白质一级构造与功能的关系一一级构造是空间构象的根底

21、20世纪60年代初，美国科学家C.Anfinsen进展牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验，提出了蛋白质一级构造决议空间构造的命题。核糖核酸酶由124个氨基酸残基组成，有4对二硫键。用尿素和-巯基乙醇处置该酶溶液，分别破坏次级键和二硫键，肽链完全伸展，变性的酶失去催化活性；当用透析方法去除变性剂后，酶活性几乎完全恢复，理化性质也与天然的酶一样。 概率计算阐明，8个半胱氨酸残基结合成4对二硫键，可随机组合成105种配对方式，而现实上只构成了天然酶的构象，这阐明一级构造未破坏，坚持了氨基酸的陈列顺序就能够回复到原来的三级构造，功能依然存在。二种属差别 大量实验结果证明，一级构造类似的多肽或蛋白质，其空间

22、构造和功能也类似，不同种属的同源蛋白质有同源序列，反映其共同进化来源，经过比较可以提示进化关系。 例如哺乳动物的胰岛素，其一级构造仅个别氨基酸差别A链5、6、10位，B链30位，它们对生物活性调理糖代谢的生理功能不起决议作用。从各种生物的细胞色素C(cytochrome c ) 的一级构造分析，可以了解物种进化间的关系。进化中越接近的生物，它们的细胞色素c的一级构造越近似。三分子病分子病是指机体DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子异常和蛋白质生物合成的异常，进而导致机体某些功能和构造随之变异的遗传病。在1904年，发现镰刀状红细胞贫血病。大约化费了40多年才清楚患病缘由，患者的血红蛋白HbS与

23、正常人的HbA相比，仅-链的第6位上，Val取代了正常的Glu。目前全世界已发现有异常血红蛋白400种以上。二、蛋白质空间构造与功能的关系 蛋白质的空间构造是其生物活性的根底，空间构造变化，其功能也随之改动。肌红蛋白Mb和血红蛋白Hb是典型的例子。肌红蛋白Mb和血红蛋白Hb都能与氧进展可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地分散。它们的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一条 S型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多，p(O2)为2.8torr(1torr133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱

24、和形状。在高p(O2)下，如在肺部大约100torr时，两者几乎都被饱和。其差别构成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。Hb未与氧结合时，其亚基处于一种空间构造严密的构象紧张态，T型，与氧的亲和力小。只需有一个亚基与氧结合，就能使4个亚基间的盐键断裂，变成松弛的构象松弛态，R型。T型和R型的相互转换对调理Hb运氧的功能有重要作用。一个亚基与其配体结合后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应，其实际解释是Hb是别构蛋白，有别构效应。第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质和氨基酸类似，有两性解离及等电点、紫外吸收和呈色反响。作为生物大分子，还有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。要了解和分析

25、蛋白质构造和功能的关系就要利用其特殊的理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法分别纯化蛋白质。一、蛋白质的高分子性质蛋白质的相对分子质量在1万100万，其颗粒平均直径约为4.3 nm胶粒范围是1100nm。准确可靠的测定方法是超离心法，蛋白质的相对分子质量可用沉降系数S表示。在球状蛋白质三级构造构成时，亲水基团位于分子外表，在水溶液中与水起水协作用，因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质。颗粒外表的水化膜和电荷是其稳定的要素，调理pH至pI、参与脱水剂等，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。透析法是利用蛋白质不能透过半透膜的性质，去掉小分子物质，到达纯化的目的。大小不

26、同的蛋白质分子可以经过凝胶过滤分开。又称分子筛层析。二、蛋白质的两性解离蛋白质和氨基酸一样是两性电解质，在溶液中的荷电形状受pH值影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。pHpI时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之那么带正电荷。在人体体液中多数蛋白质的等电点接近pH5，所以在生理pH7.4环境下，多数蛋白质解离成阴离子。少量蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白的pI偏于碱性，称碱性蛋白质，而胃蛋白酶和丝蛋白为酸性蛋白。三、蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质在某些理化要素的作用下，空间构造被破坏，导致理化性质改动，生物学活性

27、丧失，称为蛋白质的变性denaturation。蛋白量变性的本质是多肽链从卷曲到伸展的过程，不涉及一级构造的改动如加热破坏氢键，酸碱破坏盐键等。变性作用不过于猛烈，是一种可逆反响，去除变性要素，有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复，称为复性denaturation。蛋白量变性的主要表现是失去生物学活性，如酶失去催化才干、血红蛋白失去运输氧的功能、胰岛素失去调理血糖的生理功能等。变性蛋白溶解度降低，易构成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白量变性具有重要的实践意义。蛋白质自溶液中析出的景象，称为蛋白质的沉淀。盐析、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂都可沉淀蛋白质。盐析沉淀蛋白质不变性，是分别制备

28、蛋白质的常用方法。如血浆中的清蛋白在饱和的硫酸铵溶液中可沉淀，而球蛋白那么在半饱和硫酸铵溶液中发生沉淀。乙醇、丙酮均为脱水剂，可破坏水化膜，降低水的介电常数，使蛋白质的解离程度降低，外表电荷减少，从而使蛋白质沉淀析出。低温时，用丙酮沉淀蛋白质，可保管原有的生物学活性。但用乙醇，时间较长那么会导致变性。重金属盐Hg2+、Cu2+、Ag+，生物碱如三彔乙酸、苦味酸、鞣酸与蛋白质结合成盐而沉淀，是不可逆的。蛋白量变性不一定沉淀如强酸、强碱作用变性后依然能溶解于强酸、强碱溶液中，将pH调至等电点，出现絮状物，仍可溶解于强酸、强碱溶液，加热那么变成凝块，不再溶解。凝固是蛋白量变性开展的不可逆的结果。沉淀

29、的蛋白质不一定变性如盐析。四、蛋白质的紫外吸收和呈色反响蛋白质含芳香族氨基酸，在280nm波优点有特征性吸收峰，用于定量测定。蛋白质分子中的多种化学基团具有特定的化学性能，与某些试剂产生颜色反响，可用于定性、定量分析。如蛋白质分子中含有许多和双缩脲构造类似的肽键，在碱性溶液与硫酸铜反响产生红紫色络合物双缩脲反响。酪氨酸含酚基，与米伦试剂生成白色沉淀，加热后变红色。Folin-酚试剂与酪氨酸反响生成蓝色。色氨酸与乙醛酸反响，渐渐注入浓硫酸，出现紫色环。第五节 蛋白质的分类自然界蛋白质分布广泛，种类繁多，有10121013种。目前仍无法按蛋白质的化学构造进展准确的分类，普通按蛋白质的分子外形、分子

30、组成、生物功能进展分类。1按分子外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。2按分子组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。简单蛋白质完全水解的产物仅为-氨基酸。这类蛋白质按其溶解度等理化性质分为7类。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白和硬蛋白。结合蛋白质由简单蛋白质和非蛋白质辅基组成。根据辅基的不同，这类蛋白质可分为5类。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和磷蛋白。细胞核中的核蛋白是DNA与组蛋白结合而成，细胞质中的核糖体是RNA与蛋白质组成的，知的病毒也是核蛋白。免疫球蛋白是一类糖蛋白，由蛋白质与糖以共价键相连而成；脂蛋白由蛋白质与脂类经过非共价键相连，存在生物膜和动物血浆中。3按蛋白质功能

31、分为活性蛋白质和非活性蛋白质。活性蛋白质包括有催化功能的酶、有调理功能的激素、有运动、防御、接受和传送信息的蛋白质以及毒蛋白、膜蛋白等。胶原、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等是非活性蛋白质。第二章 核酸的化学教学目的：1.掌握DNA和RNA在化学组分、分子构造和生物功能上的特点。2.掌握DNA双螺旋构造模型和t-RNA二级构造的要点，了解核酸的三级构造。3.熟习核酸的性质普通性质、DNA热变性、复性与分子杂交。4.掌握基因组的概念，原核生物和真核生物基因组的特点。了解DNA测序的原理。导入：核酸是生物遗传的物质根底。它的发现和研讨进展如何？1868年瑞士青年医生Miescher从脓细胞核中分别出一

32、种含磷量很高的酸性化合物，称为核素。其继任者Altman开展了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法，于1889年提出核酸nucleic acid这一称号。早期核酸研讨因“四核苷酸假说的错误进展缓慢。1943年Chargaff等提示了DNA的碱基配对规律，1944年美国Avery利用致病肺炎球菌中提取的DNA使另一种非致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改动而成为致病菌，发现正是DNA携带遗传信息。Astbury、Franklin和Wilkins用X射线衍射法研讨DNA分子构造，得到明晰衍射图。Watson 和Crick在此根底上于1953年提出了DNA双螺旋构造模型，阐明了基因构造、信息和功

33、能三者之间的关系，奠定了分子生物学根底。1958年Crick提出“中心法那么；60年代破译遗传密码，阐明3类RNA参与蛋白质生物合成的过程；70年代诞生了基因重组和DNA测序生物技术，90年代提出人类基因组方案，21世纪进入后基因组时代。核酸的研讨成了生命科学中最活泼的领域之一。第一节 核酸的化学组成天然存在的核酸有两类，即脱氧核糖核酸deoxyribonucleic acid，DNA和核糖核酸ribonucleic acid，RNA。DNA分子是生物体的遗传信息库，分布在原核细胞的核区，真核细胞的核和细胞器以及病毒中；RNA分子参与遗传信息表达的一些过程，主要存在于细胞质。一、核酸的根本组成

34、单位核酸是一种多聚核苷酸，用不同的降解法得到其组成单位核苷酸。而核苷酸又由碱基、戊糖和磷酸组成。一 戊糖 DNA含-D-2-脱氧核糖，RNA含-D-核糖。这是核酸分类的根据。核糖中的C记为15。二碱基base 核酸中的碱基有两类：嘌呤碱和嘧啶碱。有5种根本的碱基外，还有一些含量甚少的稀有碱基。DNA和RNA中常见的两种嘌呤碱是腺嘌呤adenine，A、鸟嘌呤guanine，G。而嘧啶碱有所不同：RNA主要含胞嘧啶cytosine，C、尿嘧啶uracil，U，DNA主要含胞嘧啶、胸腺嘧啶thymine，T。tRNA中含有较多的稀有碱基修饰碱基，多为甲基化的。三核苷是碱基和戊糖生成的糖苷。经过C1

35、- N9或C1- N1糖苷键衔接，用单字符表示，脱氧核苷那么在单字符前加d。常见的修饰核苷有：次黄苷或肌苷为I、黄嘌呤核苷X、二氢尿嘧啶核苷D、假尿苷等。留意符号的意义，如m5dC。四核苷酸是核苷的磷酸酯。生物体内游离存在的多是5- 核苷酸如pA、pdG等。常见的核苷酸为AMP、GMA、CMP、UMP。常见的脱氧核苷酸有dAMP、dGMA、dCMP、dTMP。AMP是一些重要辅酶的构呵斥分如NAD+、NADP+、FAD等；环化核苷酸cAMP/cGMP是细胞功能的调理分子和信号分子。ATP在能量代谢中起重要作用。核苷酸是两性电解质，有等电点。核苷酸有互变异构和紫外吸收。含氧的碱基有酮式和烯醇式两

36、种互变异构体，在生理pH条件下主要以酮式存在二、核苷酸的衔接方式RNA和DNA链都有方向性，从5 3。前一位核苷酸的3- OH与下一位核苷酸的5位磷酸基之间构成3，5-磷酸二酯键，从而构成一个没有分支的线性大分子，两个末端分别称为5末端和3末端。大分子的主链由相间陈列的戊糖和磷酸构成，而碱基可看作主链上的侧链基团，主链上的磷酸基是酸性的，在细胞pH下带负电荷；而碱基有疏水性。讨论：列表阐明DNA和RNA在化学组成、分子构造和生物功能方面的主要特点。第二节 DNA的分子构造一、 DNA的一级构造 (primary stucture)DNA的一级构造是指分子中脱氧核苷酸的陈列顺序，常被简单以为是碱

37、基序列base sequence。碱基序有严厉的方向性和多样性。普通将5- 磷酸端作 为多核苷酸链的“头，写在左侧，如pACUGA 5 3 。 在DNA一级构造中，有一种回文构造的特殊序列，所谓回文构造即DNA互补链上一段反向反复顺序，正读和反读意义一样，经反折可构成“十字形构造，在转录成RNA后可构成“发夹样构造，有调控意义。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA DNA分子很大，最小的病毒DNA约含5000b。1965年Holley用片段重叠法完成酵母tRNAala 76nt 序列测定；1977年Sanger利用双脱氧法酶法

38、测定了X174单链DNA5386b的全序列。1990年实施的人类基因组方案HGP，用15年，投资30亿美圆，完成人类单倍体基因组DNA3109bp全序列的测定。该方案由美、英、日、法、德、中六国科学家协作，于2003年提早完成，生命科学进入后基因组时代，研讨重点从测序转向对基因组功能的研讨。二、DNA的二级构造双螺旋(double helix) 1953年，Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片DNA有0.34nm和3.4nm两个周期性变化以及Chargaff等人对DNA的碱基组成的分析A=T，G=C，A+G=C+T，推测出DNA是由两条相互缠

39、绕的链构成。Watson-Crick 双螺旋构造模型如以下图：1两条反向平行的多核苷酸链构成右手螺旋。一条链为5 3，另一条为3 5。某些病毒的DNA是单链分子ssDNA2碱基在双螺旋内侧，A与T，G与C配对，A与T构成两个氢键，G与C构成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。外表有一条大沟和一小沟。3螺距为3.4 nm，含10个碱基对bp，相邻碱基对平面间的间隔 为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定。4碱基在一条链上的陈列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。5DNA构象有多态性。Watson和Cri

40、ck根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片是相对湿度92%的DNA钠盐所得的衍射图，因此Watson-Crick 双螺旋构造称B-DNA。细胞内的DNA与它非常类似。另外还有A-DNA、C-DNA、D-DNA。1979年Rich发现Z-DNA左手螺旋、螺距4.5nm、直径1.8nm三、DNA的三级构造DNA 双螺旋进一步盘曲所构成的空间构象称DNA的三级构造。某些病毒、细菌、真核生物线粒体和叶绿体的DNA是环形双螺旋，再次螺旋化构成超螺旋；在真核生物细胞核内的DNA是很长的线形双螺旋，经过组装构成非常致密的超级构造。 1环形DNA可构成超螺旋 当将线性过旋或欠旋的双螺

41、旋DNA衔接构成一个环时，都会自动构成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋呵斥的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动构成额外的左手螺旋正超螺旋，而欠旋构成额外的右手螺旋负超螺旋。一段双螺旋圈数为10的B-DNA衔接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形DNA双螺旋的圈数=链绕数，即T=L，超螺旋数W=0；L=T+W，但将这一线形DNA的螺旋先拧松一圈再衔接成环时，解链环形DNA存在的扭曲张力，可导致双链环向右手方向扭曲构成负超螺旋T10，L=9，W = -1。在生物体内，绝大多数超螺旋DNA以负超螺旋的方式存在，也就是说，一旦超螺旋解开，那么会构成解链环形DNA，有利于DNA复制或转录。 螺旋具有

42、一样的构造，但L值不同的分子称为拓扑异构体。DNA拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可以相互转变。W的正表示双链闭环的螺旋圈在添加，W的负表示减少。L和T的正负表示螺旋方向，右手为正，左手螺旋为负；L值必定是整数。2真核细胞染色体 真核细胞DNA是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也构成超螺旋构造。DNA被严密地包装成染色体三个程度的折叠：核小体、30nm纤丝和放射环。核小体是染色体的根本构造单位，是DNA包装的第一步，它由DNA结合到组蛋白上构成复合物，在电镜下显示为成串的“念珠状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的。组蛋白有5种，H2A、H2B、

43、H3和H4各两分子组成的八聚体是核小体中心颗粒，DNA缠绕其上，相邻核小体间的DNA称为衔接DNA且结合H1。200 bpDNA的长度约为68nm，被紧缩在10nm的核小体中。紧缩比约为7。30nm纤丝是第二级紧缩，每圈含6个核小体，紧缩比是6。30nm螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，紧缩比是40。再进一步构成染色单体，总紧缩近一万倍。典型人体细胞的DNA实际长度应是180 cm，被包装在46个5m的染色体中。四、DNA和基因组1DNA分子中的最小功能单位称作基因，为RNA或蛋白质编码的基因称构造基因，DNA中具调理功能而不转录生成RNA的片段称调理基因。基因组genome是某生物体所含的全部基因，

44、即全部DNA或完好的单套遗传物质配子中的整套基因。2细菌、噬菌体、大多数动植物病毒的基因组即指单个DNA分子。最小病毒如SV40的基因组仅有5226b，含5个基因。大肠杆菌含4.6106 bp，有30004000个基因，DNA完全伸展总长约1.3mm。原核生物基因组的特点是：构造简炼，绝大部分为蛋白质编码构造基因；有转录单元，即功能相关的基因常串联一同，并转录在同一mRNA多顺反子mRNA中；有基因重叠景象，即同一段DNA携带两种不同蛋白质的信息。3真核生物基因普通分布在假设干条染色体上，其特点是：有反复序列按反复次数分单拷贝序、中度反复序和高度反复序；有断裂基因由不编码的内含子和编码的外显子

45、组成。酵母基因组有1.35107bp，含6374个基因。人类基因组有3109 bp，含4万个基因。第三节 RNA的分子构造RNA通常以单链方式存在，比DNA分子小得多，由数十个至数千个核苷酸组成。RNA链可以回折且经过A与U，G与C配对构成部分的双螺旋，不能配对的碱基那么构成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹构造。 RNA的C2位羟基是游离的，是一个易发生不良反响的位置，它使RNA的化学性质不如DNA稳定，能较DNA产生更多的修饰组分。RNA的种类、大小、构造都比DNA多样化，按照功能的不同和构造的特点，RNA主要分为tRNA、rRNA和mRNA三类。此外，细胞的不同部位还存在着另一些小分

46、子RNA，如核内小RNAsnRNA、核仁小RNAsnoRNA、胞质小RNAscRNA等，分别参与mRNA的前体hnRNA和rRNA的转运和加工过程。一、转运RNAtransfer RNA，tRNA1分子量最小的RNA，约占总RNA的15%。主要功能是在蛋白质生物合成过程中，起着转运氨基酸的作用。21965年Holley等测定了酵母丙氨酸tRNA的一级构造，并提出二级构造模型。一级构造特点：核苷酸残基数在7395；含有较多的稀有碱基如mG、DHU等；5-末端多为pG，3- 末端都是-CCA。3tRNA的二级构造为“三叶草形，包括4个螺旋区、3个环及一个附加叉。各部分的构造都和它的功能有关。5端1

47、7位与近3端6772位构成的双螺旋区称氨基酸臂，似“叶柄，3端有共同的-CCA-OH构造，用于衔接该RNA转运的氨基酸。3个环是二氢尿嘧啶环D环、反密码子环、TC环。419731975年S.H.Kim的X射线衍射分析阐明，tRNA的三级构造呈倒L字母形，反密码环和氨基酸臂分别位于倒L的两端。二、信使RNAmessenger RNA，m RNA1细胞内含量较少的一类RNA，约占总RNA的3%。其功能是将核内DNA的碱基顺序遗传信息按碱基互补原那么转录至核糖体，指点蛋白质的合成。2种类多，作为不同蛋白质合成的模板，其一级构造差别很大。真核细胞的mRNA有不同于原核细胞的特点：3- 末端有多聚Apo

48、lyA尾，5-末端加有一个“帽式构造,m7 Gppp。 3代谢活泼，寿命较短。三、核糖体RNAribosomal RNA，rRNA1约占细胞总RNA的80%。主要功能是与多种蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的场所。2核糖体在构造上可分别为大小两个亚基。原核细胞的rRNA有3种，23S与5S rRNA在大亚基，16S在小亚基。真核细胞有4种rRNA，其中大亚基含28S、5.8S、5S，小亚基只需18S。3. 各种rRNA的一级构造中的核苷酸残基数及其顺序都不一样，且有特定的二级构造。第四节 核酸的性质一、普通理化性质1DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；都微溶于水，不溶于普通有机溶剂。常用乙

49、醇从溶液中沉淀核酸。2具有大分子的普通特性。分子大小可用Da、b或bp、S、链长m表示。一个bp相当的核苷酸平均分子量为660Da；1m长的DNA双螺旋相当3000bp或2106Da。3两性电解质。各种核酸的大小及所带的电荷不同，可用电泳和离子交换法分别。RNA在室温下易被稀碱水解，DNA较稳定，此特性用来测定RNA的碱基组成和纯化DNA。4紫外吸收，最大吸收峰在260nm处，核酸的变性或降解，吸光度A升高，称为增色效应。二、核酸的变性和复性1变性的概念在理化要素作用下，核酸的双螺旋区氢键断裂，空间构造破坏，构成单链无规线团形状的过程。变性的要素有热、酸、碱、乙醇、尿素等。变性的本质是次级键的

50、变化。变性的结果是紫外吸收值明显添加增色效应，DNA粘度下降，生物学功能部分或全部丧失。2DNA的热变性和TmDNA热变性过程中，紫外吸收值增高，有一个特征性曲线称熔解曲线，通常将熔解曲线的中点，即紫外吸收值到达最大值50%时的温度称为解链温度，又叫熔点Tm。DNA的热变性是迸发式的，像结晶的溶解一样，只在很狭窄的温度范围内完成，普通在70800C之间。变性温度与碱基组成、DNA长度及变性条件有关。GC含量越高，Tm越大；DNA越长，Tm越大；溶液离子强度增高，Tm添加。3DNA的复性与分子杂交 变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新配对，恢复天然双螺旋构象，这一景象称为复性。热变性的DNA

51、经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火annealing。影响复性速度的要素很多，如单链DNA的起始浓度、温度最适复性温度是比Tm约低250C、盐浓度、片断长度、序列复杂性等。分子杂交是以核酸的变性和复性为根底，只需不同来源的核酸分子的核苷酸序列含有可以构成碱基互补配对的片段，就可以构成DNA/DNA，RNA/RNA或DNA/RNA杂化双链，这个景象称为核酸分子杂交hybridization。标志一个来源的核酸放射性同位素或荧光标志，经过杂交可以检测与其有互补关系的DNA或RNA，这种标志的核酸称为基因探针gene probe，也就是一段带有检测标志，且顺序知，与目的基因互补的核酸序列。基因探

52、针的“集成化 就是基因芯片gene chip。是把曾经测序的基因固定在硅片或玻璃片上制成的。在医疗诊断和科学研讨中已被快速地运用。三、核酸的序列测定DNA序列是指携带遗传信息的DNA分子中的A、C、G、T的序列。分析方法主要有两种，一种是Maxam-Gilbert化学法，另一种是Sanger的双脱氧法。如今普通都采用后者，其根本原理是：1用凝胶电泳分别待测的DNA片段用作模板。2将模板、引物、4种dNTP、适宜的聚合酶置于4个试管，每一试管按准确比例各参与一种ddNTP，用同位素或荧光物质标志。3利用ddNTP可特异地终止DNA链延伸的特点，4个试管的聚合反响可以得到一系列大小不等、被标志的片

53、段。4将4个反响管同时加到聚丙烯凝胶上电泳，标志片段按大小分别，放射自显影后可按谱型读出DNA序列。在以上两种方法的根底上，经过与计算机技术和荧光技术的结合，发明了自动测序仪。目前，常用的测序战略是“鸟枪法，笼统地说是将较长的基因片段打断，构建一系列的随机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的DNA定序。第三章 酶教学目的：1掌握酶的概念和作用特点，了解酶的分类与命名。2熟习酶的分子组成、构造与功能单纯酶和结合酶，酶的辅因子、维生素的类别与功能，酶的活性部位，酶原激活，同工酶、变构酶和抗体酶。3熟习酶的作用机制。4熟习影响酶促反响的要素酶浓度、底物浓度、温

54、度、pH、激活剂与抑制剂；掌握酶促反响速度的表示、米氏方程和米氏常数的意义。5了解酶的制备与运用。第一节 概 论导入：酶学知识来源于消费与生活实际。我们祖先很早就会制酱和酿酒。西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内Kuhne首先把这类物质称为酶enzyme，其意“在酵母中 。1860年法国科学家巴斯德Pasteur以为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂那么失去发酵作用。1897年，Buchner兄弟初次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用

55、的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶1946年二人共获诺贝尔化学奖。1963年测定第一个牛胰RNaseA序列124aa；1965年提示卵清溶菌酶的三维构造129aa。一、酶的概念酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂biocatalyst。已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶enzyme，生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。美国科学家Cech于1981年在研讨原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme，为数不多，主要做

56、用于核酸1989年的诺贝尔化学奖。二、酶的作用特点酶所催化的反响称为酶促反响。在酶促反响中被催化的物质称为底物，反响的生成物称为产物。酶所具有的催化才干称为酶活性。酶作为生物催化剂，具有普通催化剂的共性，如在反响前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反响，即自在能由高向低转变的化学反响；不改动反响的平衡点。但是，酶是生物大分子，又具有与普通催化剂不同的特点。1极高的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反响高1081020倍，比普通催化剂高1071013倍。例如，脲酶催化尿素的水解速度是H+催化作用的71012倍；碳酸酐酶每一酶分子每秒催化6105 CO2与水结合成H2CO3，比非酶促反响快1

57、07倍。 2高度的特异性酶对催化的底物有高度的选择性，即一种酶只作用一种或一类化合物，催化一定的化学反响，并生成一定的产物，这种特性称为酶的特异性或专注性。有构造专注性和立体异构专注性两种类型。构造专注性又分绝对专注性和相对专注性。前者只催化一种底物，进展一种化学反响。如脲酶仅催化尿素水解。后者可作用一类化合物或一种化学键。如酯酶可水解各种有机酸和醇构成的酯。在动物消化道中几种蛋白酶专注性不同，胰蛋白酶只水解Arg或Lys羧基构成的肽键；胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基构成的肽键。立体异构专注性指酶对底物立体构型的要求。例如乳酸脱氢酶催化L-乳酸脱氢为丙酮酸，对D-乳酸无作用；L

58、-氨基酸氧化酶只作用L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。3酶活性的可调理性酶促反响受多种要素的调控，经过改动酶的合成和降解速度可调理酶的含量；酶在胞液和亚细胞的隔离分布构成酶的区域化调理；代谢物浓度或产物浓度的变化可以抑制或激活酶的活性；激素和神经系统的信息，可经过对关键酶的变构调理和共价修饰来影响整个酶促反响速度。所以酶是催化剂又是代谢调理元件，酶程度的调理是代谢调控的根本方式。4酶的不稳定性酶主要是蛋白质，凡能使蛋白量变性的理化要素均可影响酶活性，甚至使酶完全失活。酶催化作用普通需求比较温暖的条件37、1atm、pH7。三、酶的分类与命名一酶的分类根据国际酶学委员会International

59、Enzyme Commission，IEC的规定，按照酶促反响的性质，分为六大类：1氧化复原酶oxidoreductases催化底物进展氧化复原反响。如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。2转移酶transferases催化底物之间某些基团的转移或交换。如甲基转移酶、氨基转移酶、磷酸化酶等。3水解酶hydrolases催化底物发生水解反响。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。4裂解酶lyases催化底物裂解或移去基团构成双键的反响或其逆反响。如碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合成酶等。5异构酶(isomerases) 催化各种同分异构体之间相互转化。如磷酸丙糖异构酶、消

60、旋酶等。6合成酶(ligases) 催化两分子底物合成一分子化合物，同时偶联有ATP的分解释能。如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-RNA衔接酶等。二酶的命名1961年，国际酶学委员会(IEC)主要根据酶催化反响的类型,把酶分为6大类，制定了系统命名法。规定每一酶只需一个系统称号，它标明酶的一切底物与催化反响性质，底物称号之间以“：分隔，同时还有一个由4个数字组成的系统编号。如谷丙转氨酶的系统称号是丙氨酸：- 酮戊二酸氨基转移酶酶表中的一致编号是EC2.6.1.2。乳酸脱氢酶的编号是EC1.1.1.27。第二节 酶的分子组成、构造和功能一、酶的分子组成一单纯酶和结合酶单纯酶是仅由肽链构成的酶。如脲酶、一