提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板

1、.WD.WD.WD.【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清不回收，直接倒去；02、1mL/孔 PBS洗两遍不回收，直接倒去，随后用200L枪吸尽PBS；03、每孔加500L Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、参加100L氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4离

2、心机，12000g，15min；07、吸200L(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中注意：只能吸到上清；08、参加等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，参加1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，参加1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中参加40L(40-60L)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度先知楼21楼测RNA浓度，带

3、DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头；三、本卷须知01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20冰箱。但长时间(24h)保存，需要放在-80冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10L枪头(RNA专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、翻开电脑=翻开“N软件=点击“Nucleic acid=选择“OK=选择“RNA；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水 校零：即加DEPC水一滴

4、，点击“Blank，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度0.1。请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值0.1；2.A280nm、A270nm是 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B5%B0%B0%D7&k0=%B5

5、%B0%B0%D7&kdi0=0&luki=6&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进展 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0

6、&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%BA%CB%CB%E1&k0=%BA%CB%CB%E1&kdi0=0&luki=8&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_bl

7、ank 核酸样品纯度评估：纯 DNA 的 A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白芳香族或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于50 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&k0=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&kdi0=0&luki=2&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteer

8、ror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进展核酸样品纯度评估：纯DNA 和 RNA的A260/A230比值为2.5。假设比值小于2.0 标明样品被碳水化合物糖类、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230

9、产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。4. A320nm或A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B4%BF%BB%AF&k0=%B4%BF%BB%AF&kdi0=0&luki=1&mcp

10、m=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 纯化样品。纯样品的A320一般是0。5. A260/A280和A260/A230 是 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=

11、news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%BA%CB%CB%E1&k0=%BA%CB%CB%E1&kdi0=0&luki=8&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank

12、 核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。纯洁的样品比值大于1.8DNA或者2.0RNA。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%CC%BC%CB%AE%BB%AF%BA%CF%CE%EF&k0=%CC%BC%CB%

13、AE%BB%AF%BA%CF%CE%EF&kdi0=0&luki=4&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 碳水化合物、盐胍盐等，较纯洁的核酸A260/A230的比值大于2.0。当0.5BSA HYPERLINK :/cpro.baidu /

14、cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&k0=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&kdi0=0&luki=2&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/

15、201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B7%D6%D7%D3&k0=%B7%D6%D7%D3&kdi0=0&luki=3&mcpm=0&n=10&p=baid

16、u&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/2801.7，260 /2300.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用 HYPERLINK :/cpr

17、o.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B7%D6%B9%E2%B9%E2%B6%C8%BC%C6&k0=%B7%D6%B9%E2%B9%E2%B6%C8%BC%C6&kdi0=0&luki=5&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&

18、td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 分光光度计测量RNA时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul左右。6.当260/230加1号试剂2L=加3号试剂(0.5L)=加4号试剂(0.5L)=加2号试剂(0.5L)=加RNA=离心=上机；02、上机：OPEN=点击“User菜单下的“clx，

19、点击“Accept=选择“run下面的到“exp001 rt=修改体系“10L(默认为25微升)=点击“Start，进入界面；03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min；04、4冰箱保存；三、本卷须知01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止RNA降解；【qRT-PCR】一、实验准备：01、试剂：Roche的SyBr Green(rox)02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八连冠；10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L枪；03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻GAPDH、cDNA、DEPC水；二、操作步骤：01、

20、 Rox 10L；+ dd H2O 6L；+ P1(F) 1 + P2(R) 1 + cDNA 2-20L体系02、计算：每个样，X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的)，三个副孔。 即如果六个样，2个抗体(GAPDH,PLK1)，三个副孔。6*1*3=1820(PLK1)，6*1*3=1820(GAPDH)；1234567891011126/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK1

21、1/PLK11/PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1 Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L GAPDH Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L03、稀释cDNA 10倍(18L DEPC水+2L)=配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=加样(一横排先加18L mix(GAPDH)，随后参加18L mix(PLK1)。 随后六个孔加同一个cDNA；06、去除

22、气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后2000rpm离心，时间不定(5s即可)；07、上机+设置程序： A、双击翻开程序“StepOne Software v2.1 =点击“ OK =点击“Ignore & Continue Startup =点击“Advanced Setup =进入“ Experment Properties界面 ；B、Experment Properties界面： 将Expriment Name从Untitled 修改为“日期，如2015-12-17，将User Name(Optional)修改为“CZL；Which instrument are you u

23、sing to run the experiment ?中选择“96 wells，一般无需修改；What type of experiment do you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative CT(CT)；Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中选择“SYBR Green Reagents； Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中选择“Fast( 40 minutes to complete a run)；C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面： Define Targets栏中：如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物，那么点击“Add New Target 三下，出现“Target1、Target2、Targ