抗生素概述、分类和发酵生产工艺课件

1、抗生素概述、分类和发酵生产工艺3.1 概述3.2 青霉素的发酵生产工艺3.3 链霉素的发酵生产工艺3.4 红霉素的发酵生产工艺3.5 四环素的发酵生产工艺3.1.1 抗生素的定义生物在其生命活动过程中产生（或用化学、生物或生物化学方法衍生的）的在低微浓度下能选择性的抑制他种生物机能的化学物质。天然抗生素，主要利用微生物发酵，通过生物合成生产的天然代谢产物。半合成抗生素：经过化学，生物或生化方法进行了分子改造，制成的这种衍生物，为半合成抗生素。如氨苄青霉素（Ampicillin）。海洋中提取的抗生物质如黄连素、海星皂苷等也属于抗生素范畴。（1）根据来源生物的属名定名抗生素，如青霉素。（2）根据化

2、学结构和性质定名抗生素，如四环素类抗生素。（3）一些习惯性俗名、发现的地名等命名，如正定霉素、井冈霉素、金霉素、土霉素等。3.1.2 抗生素的命名原则、抗生素的分类根据微生物来源分类 ；根据抗生素的作用机制分类；按医疗作用对象分类 ；按作用性质分类；按抗生素获得途径分类；按应用范围分类；根据生物合成途径分类；根据化学结构分类 。细菌结构与抗菌作用部位示意图-内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内脂类抗生素抗生素的化学结构分类3.1.4 抗生素生产工艺技术的研究第1条途径：微生物发酵生产工艺。目前大多数抗生素品种采用发酵生产工艺，其特点是成本较低，周期较长。第2条途径：全化学合成生产

3、工艺，结构相对简单的抗生素可采用此途径。第3条途径：半合成生产工艺，利用化学方法修饰改良生物合成的抗生素，扩大抗菌谱、提高疗效和降低毒副作用等，获得新抗生素。微生物合成抗生素包括上游的发酵和下游提取两部分，对于剂型产品，还需要经过相应的制剂工艺。3.2 -内酰胺类抗生素青霉素3.2.1 发展概况 1929年，英国的Fleming青霉素的发现。1940年，Florey & Chain, 临床应用青霉素。1945年，意大利的Brotzu发现一株顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)，并证明它的代谢产物具有广谱抗细菌作用;1953年，Abraham头孢菌素C。 1958年，青

4、霉素母核6-氨基青霉烷酸(6-APA);1960年，头孢菌素C母核7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA) -内酰胺类抗生素抗菌机制1、抑制胞壁粘肽合成酶，阻碍粘肽合成，使细胞壁缺损，菌体破裂死亡。-内酰胺环与粘肽五肽的最后二肽（D-丙氨酰-D-丙氨酰）立体构型似，可选择性与转肽酶（肽合成酶，PBPs）结合阻碍粘肽的交叉联结。对生长中的细胞有效，静止细胞无效。2、触发细菌自溶酶活性。结构特性-lactams青核(penam)头核(cepham)青霉素头孢菌素6-氨基青霉烷酸(6-APA)(母核)苯乙酸（侧链）D-氨基已二酸(侧链)7-氨基头孢菌酸(7-ACA)(母核)临床应用的主要-内酰胺抗生素 天然

5、青霉素：苄青霉素（青霉素G）和青霉素V（苯氧甲基青霉素）。对革兰阳性细菌有很强的抗菌活性，易受-内酰胺酶作用失活而对耐药菌无效。天然头孢菌素：头孢菌素C和7-甲氧头孢菌素C（头霉素C）。广谱抗细菌作用，且对青霉素酶稳定；后者还能耐受头孢菌素酶。青霉素的优点是毒性小，但其降解物或聚合物易引起免疫变态反应，即过敏反应，临床应用前需要进行皮试。青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对革兰氏阴性菌无效。几种天然青霉素命名及其活性序号俗名学名侧链取代基R-生物活性（U/mg钠盐）1青霉素G苄青霉素C6H5-CH2-16672青霉素X对羟基苄青霉素HO-C6H5-CH2-9703青霉素F2-戊烯基青

6、霉素CH3-CH2-CH=CH-CH2-16254青霉素K庚青霉素CH2-(CH2)5-CH2-23005双氢霉素F戊青霉素CH2-(CH2)3CH2-16106青霉素V苯氧甲基青霉素C6H5-O-CH2-1595青霉素的理化性质青霉素是有机酸，易溶于醇、酸、醚、酯类。在水中溶解度很小，且很快失去活性。青霉素G的pK值为，能与无机或有机碱成盐。青霉素盐极易溶于水，但难溶于有机溶剂。3.2.2 青霉素的发酵生产菌种1928年， Fleming 分离的点青霉（Penicllium notatum）；生产能力很低，远不能满足工业生产的要求。19381941年H.W.F.弗洛里和E.B.钱恩经分离制得

7、青霉素，并发现它对许多严重的全身性细菌感染有良好治疗效果，是一个高效低毒抗生素。1943年从美国皮奥利亚一位农妇的发霉甜瓜上分离得到一株产黄青霉（Penicillium chrysogenum NRRL1951）。青霉素生产菌种按孢子形态分为绿色孢子和黄色孢子的两种产黄青霉（Penicillium chrosogenum）菌株。产黄青霉在液体培养基中菌丝可发育成两种状态，即球状菌和丝状菌。目前生产商采用的是绿色丝状菌株。黄色孢子菌落平坦或褶皱，圆形，边沿整齐或锯齿或扇形气生菌丝形成大小梗，上生分生孢子，排列成链状，似毛笔，成为青霉穗孢子圆形或圆柱形绿色孢子在整个发酵培养过程中，产黄青霉的生长发

8、育可分为7个阶段：第I期分生孢子发芽，孢子先膨胀，再形成小的芽管，原生质未分化，有小空胞；第期菌丝增殖，原生质的嗜碱性很强，在期末有类脂肪小颗粒；第期形成脂肪粒，积累贮藏物，没有空胞，原生质嗜碱性仍强；第期脂肪粒减少，形成中小空胞，原生质嗜碱性减弱；开始产抗生素；第V期形成大的空胞，其中含有一个或数个中性红染色的大颗粒，脂肪粒消失 ；青霉素产量最高；第期细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞，释放氨，pH上升；第期菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。镜检控制规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。第14期为菌丝生长期，第3期的菌体适宜为种子。第45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，

9、延长此期，获得高产。第6期到来之前结束发酵。3.2.3 青霉素的发酵工艺流程冷冻管孢子培养25,7天斜面母瓶孢子培养25,7天大米孢子种子培养27,50h1:3vvm一级种子培养液种子培养25,14h1:(11.5)vvm二级种子培养液变温发酵26-24200h1:(0.71.8)vvm发酵液丝状菌三级发酵工艺流程：种子制备种子制备过程可分为两大阶段（如图）：a b实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养）。生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养。 生产孢子制备工艺斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养。米孢子：移植到小米或大米

10、固体培养基上，生产7天，25。注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，CaCO3，玉米油，消泡剂等。空气流量1:3（体积比），300350 rpm，pH自然， 温度271, 培养40 h。二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10 %培养基：葡萄糖，玉米浆，玉米油，消泡剂等1:(11.5)，250280 rpm， pH自然， 251， 培养1014 h。质量：菌丝致密，菌丝粗壮，期，倍增期68 h1. 种子罐级数的确定 种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这要根据菌种生长的特性、孢子发芽速度

11、和菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。 接种种龄和接种量接种龄：接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，即对数生长期最合适。 接种量：抗生素的工业生产，大多数发酵的最适接种量为715或更多。 种子质量要求：菌丝稠密，菌丝团很少，菌丝粗壮，有中小空胞，处在第期。搅拌器冷却水进口放料口无菌空气培养液冷却水出口排气口pH检测及控制装置电动机加料口发酵罐示意图反复分批式两段变温发酵发酵罐：100 m3，装料80 m3，接种量20 %。培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，碳酸钙，玉米油，硅油。参数条件：1:(0.81.2)；150200 rpm；前60 h，26 ；60 h后，pH6.

12、7, 24 。带放：6-10次，间隔24 h，带放量10 %。发酵周期：180220 h。补料：连续流加葡萄糖、(NH4)2SO4以及前体物质苯乙酸盐。关键：补糖率。青霉素的生产周期3.2.4 影响发酵产率的因素及发酵过程控制基质浓度的影响前体的影响温度的影响和控制pH的影响和控制溶氧的在线控制消泡3.2.4.1 基质浓度的影响前期基质浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏(或抑制)或对菌丝生长产生抑制(如葡萄糖和铵的阻遏或抑制，苯乙酸的生长抑制)；后期基质浓度低，限制了菌丝生长和产物合成。碳源的选择碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长

13、。当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。碳源占成本12 %以上，采用糖化液流加，降低成本。葡萄糖浓度的调节是根据pH、溶解氧或CO2释放率予以调节。什么是6-APA6-氨基青霉烷酸 6-APA由青霉素钾盐酶化裂解而成，是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫西林的重要中间体。发酵过程中也产生6-APA，但产量很低。糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素产量。 在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40 h生长，而在40 h后，靠低速连续流加葡萄糖和氮源等，使菌体处于半饥饿状态，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。残糖0.30.6 %左右，pH开始

14、升高时流加糖浓度：500 kg/m3；流速：1.01.25 kg/(m3h)发酵动力学菌体干重残糖流加氮源控制玉米浆：最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。但其质量不稳定，产量较少，故可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素（有机氮）。氨基氮浓度：控制在0.010.05%间。盐离子控制硫和磷：硫浓度降低时青霉素产量减少3倍；磷浓度降低时青霉素产量减少1倍。钙、镁和钾：合适的阳离子比例为钾30%、钙20%、镁41%。如镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。铁易渗入菌丝内，对青霉素合成有毒，3040g/m

15、l以下，故罐壁涂环氧树脂保护层。3.2.4.2 前体的影响及控制 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G的侧链前体。利用途径：青霉菌可将前体直接结合到产物分子中，也可作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径被菌利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。 前体的毒性：前体对青霉菌的生长发育有毒性，其毒性大小取决于培养基的pH值和前体的浓度。苯乙酰胺在碱性时毒性较大，pH=8时即抑制菌体生长；苯乙酸在酸性(pH=5.5)时毒性较大，碱性时不抑制菌丝体生长；pH值在中性时苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体浓度一般始终维持在为宜。前体的氧化培养基的成分，p

16、H，菌龄苯乙酸被菌体氧化的速率，随培养基的pH值上升而增加。 苯乙酸被菌体氧化的速率，随着菌龄的增大而增加。间歇或连续添加低浓度苯乙酸的办法，保持前体的供应速率仅略大于生物合成的需要。 3.2.4.3 提高产量的其他物质流加表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯。可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇。其他：剪切保护剂；分散剂。3.2.4.4 温度的影响及控制 一般生长的适宜温度为30，而分泌青霉素的适宜温度是在20，但周期很长。变温控制法，生长阶段较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。如采用从26逐渐降

17、温至24的发酵温度。3.2.4.5 pH值的影响及控制 最适pH值，一般认为是，应尽量避免超过在青霉素发酵过程中pH值是通过下列手段控制的：pH值过高，可加糖、硫酸或无机氮源；pH值较低可加入CaCO3、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。也有利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液pH值维持在最适范围，以提高青霉素产量补糖方式控制 pH ：一种是恒速补糖，用酸或碱来控制pH值；另一种是根据pH值来补糖，即pH值上升得快就多补，pH值下降时少补，以维持范围。 3.2.4.6 溶氧的在线控制溶氧30饱和度以下时，青霉素产量急剧下降；溶氧10饱和度以下时，则造成不可逆转的损失。溶氧浓度过高，菌丝生长不良

18、或加糖率过低通气比：1:（）。适宜的搅拌速度：保证气液混合，提高溶氧。调整搅拌转速：各阶段的生长和耗氧量不同。葡萄糖流加控制的参考指标之一。3.2.4.7 泡沫控制天然油脂：玉米油；化学消泡剂：泡敌；策略：少量多次；注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。3.2.5 青霉素的分离纯化工艺过程青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活；水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定；易溶于有机溶剂，水中溶解度很小；青霉素盐很稳定，降解产物具有致敏性；防止降解，条件需温和、快速。青霉素的生物合成与理论产量一氨基己二酸的生物合成 ：葡萄糖+NH3+0.5ADP+0.5Pi+6NAD+ 一氨基己二酸+3C02+0.5Pi+6N

19、ADH (I)前体氨基酸的生物合成 (3)半胱氨酸的生物合成 ：葡萄糖+NH3+SO42-+12.5ATP+4NADH+FAD 半胱氨酸+AMP+PAP+10.5ADP+9.5Pi+2PPi+4NAD+FADH2 (III)(2)缬氨酸的生物合成 ： 葡萄糖+NH3+0.5ATP 缬氨酸+C02+0.5ADP+0.5Pi (11) 青霉素的合成半胱氨酸+缬氨酸+ -氨基己二酸+苯乙酸+ADP+Pi+3ATP+NAD+FAD青霉素G+6-氧氢化吡啶-2-羟酸+4AMP+4PPi+NADH+FADH2 (V)将式(I)、()、()、(V)相加，得青霉素G生物合成的总化学式：3葡萄糖+3NH3+SO

20、42-+苯乙酸+1.5ATP+3NAD+2FAD 青霉素G+6-氧氢化吡啶-2-羟酸+4CO2+PAP+5AMP+6PPi+9.5ADP+8.5Pi+3NADH+2FADH2 青霉素的理论生产得率： 葡萄糖+3NH3+SO42-十苯乙酸2青霉素G+6-氧氢化吡啶-2-羟酸2 相对的基质符号 表示单位 备注 molmol ggUmg 葡萄糖 氨 氧 苯乙酸 Yps Ypn Ypo Ypp 0.31 0.39 0.33 0.42 0.26 1.0 0.6l 0.77 6.99 8.87 2.94 2.62 1022 1284 11649 14789 4893 4364 ,以青霉素G钠盐表示。-氨基

21、己二酸不循环使用。64的-氨基己二酸循环使用。表 青霉素的理论生产得率提炼工艺过程步骤：发酵液的预处理和过滤青霉素的提取青霉素的精制及烘干3.2.5.1 发酵液的过滤和预处理 目的：分离菌体，除去杂质杂质：高价无机离子（Ca2+,Mg2+,Fe3+）和蛋白质Ca2+草酸，草酸钠Mg2+三聚磷酸钠Fe3+黄血盐（亚铁氰化钾）蛋白质等电点，加明矾或絮凝剂法发酵液和滤液10一次过滤鼓式真空过滤机一次滤液：，略发浑，棕黄色或棕绿色。蛋白质含量一般在2.0 mg/ml（个别情况下可达到7.0 mg/ml）二次过滤：澄清透明，用于提取（收率90%）板框过滤机0.07%硅藻土，作为助滤剂硫酸酸化去除蛋白质：

22、硫酸调加入0.07%溴代十五烷吡啶（PPB，去乳化剂，破坏W/O型乳浊液）图1 滤框和滤板1-滤框 2-滤板 3-滤板外框架 4-滤板栅 5-支撑格筛 6-压盖框图2 板框压滤机外形 1-固定端板2-滤板 3-滤框 4-活动端板 5-活络接头 6-支承 7-传动齿轮 9-手轮 图5 板框式压滤机操作示意图(a) 过滤阶段 (b)洗涤阶段实际上，随着高效高速萃取离心机的出现，如德国Westfalia公司出品的倾析器（decantor），可省去过滤工序，比用板框过滤除去菌丝后再提取的收率高出23%。3.2.5.2 青霉素的提取和精制 溶剂萃取法原理： 青霉素与碱金属所生成的盐类在水中溶解度很大，而

23、青霉素游离酸易溶解于有机溶剂中。 萃取（extraction）是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作，所以，萃取操作中至少有一相为流体，一般称该流体为萃取剂（extractant)。 萃取分离的特点：1、 比化学沉淀法分离程度高；2、 比离子交换法选择性好、传质快；3、 比蒸馏法能耗低， 生产能力大，周期短，连续操作，可以自动化控制；4、 和其他新型分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术。有机溶剂的选择 相似相溶的原理有机溶剂还应满足以下要求：(1)价廉易得；(2)与水相不互溶；(3)与水相有较大的密度 差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易；(4)容易回收

24、和再利用；(5)毒性低，腐蚀性小，闪点低，使用安全；(6)不与目标产物发生反应。 表 青霉素的分配系数溶 剂pH=2.5(溶剂水)pH=7.0(溶剂水)溶 剂pH=2.5(溶剂水)pH=7.0(溶剂水)醋酸戊酯45/11/235氯 仿39/11/220醋酸丁酯47/11/186三氯乙烯21/11/260醋酸乙酯39/11/260乙 醚12/11/190逆流萃取过程正向萃取：酸化，滤液:醋酸丁酯，碟片式离心机分离（浓缩倍）反相萃取：（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取23次，达到结晶要求。萃取条件：10。萃取罐冷冻盐水冷却。温度的影响 一般来说，温度升高则引起互溶的程度增加，当升高至某一温度时，甚至可使两相区消失，这样萃取操作成为不可能。一方面，降低系统的温度可提高萃取效率与料液的分离程度。 另一方面，降低操作温度会使液体粘度增大，扩散系数减少，并增加整个系统的冷却负荷和动力消耗。 整个萃取过程应在低温下进行（在10以下），在保证萃取效率的前提下，尽量缩短操作时间，减少青霉素的